[發明專利]一種棘孢木霉菌的篩選方法及其應用

無效

• 申請號: 201010122176.6
• 申請日: 2010-03-11
• 公開（公告）號: CN102191180A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 曾希柏;蘇世鳴;蔣細良;白玲玉;李蓮芳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/02;G01N21/64;B09C1/10;C12R1/885
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• 代理人: 暫無信息

1.一種棘孢木霉菌的篩選方法，包括：

采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從所述土壤樣品中分離出真菌，將所述真菌在不同砷濃度下培養，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出所述棘孢木霉菌。

2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括：

將所述土壤樣品經梯度稀釋后涂布于砷含量為400～600mg/L的馬丁培養基上分離出所述真菌；

將分離出的真菌經多次純化、培養后，取直徑為8～10mm的圓形真菌菌塊或邊長為8～10mm的方形真菌菌塊，置于含砷1000mg/kg的PGP培養基上，比較所述菌落的生長狀況，從中篩選出具有較高抗砷能力的所述棘孢木霉菌菌株。

3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，所述馬丁培養基的成分包括：葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、瓊脂以及水，各成分的重量比為20∶10∶2∶1∶80∶4000；

所述PGP培養基的成分包括：馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為40∶4∶1∶400。

4.一種棘孢木霉菌對砷的抗性的鑒定方法，包括：

在室內培養條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發能力，以及在含有不同濃度砷溶液的培養條件下棘孢木霉菌生物量的變化，由此鑒定所述棘孢木霉菌對砷的抗性。

5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室內培養條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發能力，具體包括：

配制總砷含量為50mg/L的PGP培養基，在120～125℃下滅菌14～17分鐘后，接入0.1ml棘孢木霉菌生物量為10⁴cfu/ml的菌懸液，培養溫度為24～27℃，轉速為138～142rmp，培養5天后，以3800～4200rmp進行離心處理8～12分鐘，用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基，將菌質于48～52℃下烘干至恒重，然后對菌質稱重，用11～13ml體積比為4～6∶1的HNO₃、HClO₄混合液在158～162℃條件下將菌質消煮10小時，采用原子熒光測定菌質中的總砷含量；將離心出的培養液及清洗菌質的超純水混合后作為上清液采用所述原子熒光測定總砷含量；

所述菌質中的總砷含量作為棘孢木霉菌對砷的生物累積量，棘孢木霉菌對砷的揮發量＝配置的總砷含量-所述菌質中的總砷含量-所述上清液中的總砷含量。

6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于，

參照在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中接入棘孢木霉菌的處理，分別以在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中不接入棘孢木霉菌處理以及在PGP培養基中接入棘孢木霉菌而不添加砷的處理作為對照，對每項處理均重復多次。

7.按照權利要求5所述的方法，其特征在于，在室內條件下測定在含有不同濃度砷溶液的培養條件下棘孢木霉菌生物量的變化，具體包括：

配制總砷含量范圍為0～200mg/L的PGP培養基，在120～122℃溫度下滅菌14～16分鐘后，將生長速率相同的8～10mm棘孢木霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23～27℃，轉速為138～142rmp振蕩培養；培養5天后，培養液以3800～4200rmp離心8～12分鐘，并采用稀釋梯度法對懸液中的孢子數目進行計數；

用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基后，將所述菌質于48～52℃下烘干至恒重，然后稱量所述菌質重量，即所述棘孢木霉菌生物量。

8.按照權利要求7所述的方法，其特征在于，將不同砷含量下的相應處理均重復多次。

9.按照權利要求8所述的方法，其特征在于，還包括：

觀察隨著所述培養液中總砷含量的增加所述棘孢木霉菌生物量的變化趨勢，并觀察所述棘孢木霉菌生物量達到最高時所述培養液的砷含量，由此確定所述棘孢木霉菌表現出的對砷抗性的含量范圍。

10.一種棘孢木霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及農產品中累積方面的應用。