[發(fā)明專利]檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列、方法及試劑盒

有效

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• 申請日: 2010-03-09
• 公開（公告）號: CN102010894A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊慧
• 申請（專利權(quán)）人: 上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京元中知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11223
• 代理人: 王明霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列、檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

靶向治療是近年來腫瘤領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，同以往經(jīng)典的化療治療效果比較，靶向藥物顯著延長患者的無進(jìn)展生存期(PFS)和整體生存期(OS)，同時降低藥物的不良反應(yīng)。美國FDA已經(jīng)成功的將下列藥物批準(zhǔn)用于上述腫瘤的治療，如：Trastuzumab(赫塞汀)治療乳腺癌，Gefitinib(易瑞沙)和Erlotinib(特羅凱)治療非小細(xì)胞肺癌，Cetuximab(愛必妥)治療結(jié)直腸癌，Sunitinib(舒尼替尼)和Sorafenib(索拉非尼)治療腎細(xì)胞癌。

由于在靶向治療之前需要進(jìn)行靶向診斷，所以如何準(zhǔn)確地進(jìn)行靶向診斷是決定治療有效與否的前提。大量臨床研究資料證實(shí)，Kras基因突變狀態(tài)與針對EGFR的藥物，如Cetuximab(愛必妥)和Panitumumab(帕尼單抗)等的療效有關(guān)，應(yīng)用抗EGFR的藥物治療腫瘤有必要檢測Kras基因的突變。

Kras基因突變檢測已被寫入最新版的《NCCN結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》，新指南傳遞給廣大醫(yī)生和患者兩條重要信息：一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測Kras基因狀態(tài)；二是只對Kras基因野生型患者推薦介紹抗EGFR藥物治療。

K-ras基因，是人體腫瘤中常見的致癌基因，位于EGFR下游的Ras-Raf-Mek信號途徑，該途徑的異常也會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長和腫瘤的進(jìn)程。K-ras基因某些關(guān)鍵位點(diǎn)易發(fā)生突變，并且主要集中在特定的氨基酸密碼子(第12、13、61密碼子)上，其中12、13占所有突變的90％，這些突變使KRAS蛋白持續(xù)保持活化狀態(tài)而不再受上游EGFR的調(diào)控，導(dǎo)致針對EGFR靶標(biāo)的藥物(Erbitux，Vectibix，Iressa，Tavceva等)失效。這種突變在胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中發(fā)生率較高較為常見。

因此，Kras基因突變檢測是目前醫(yī)生了解結(jié)直腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法，通過檢測不僅可以深入了解癌基因的情況，更重要的是篩選出針對抗EGFR靶向藥物治療有效的結(jié)直腸癌患者，幫助臨床醫(yī)生選擇制定對腫瘤患者最有效的治療方案。目前在歐美等發(fā)達(dá)國家，kras基因檢測已經(jīng)成為結(jié)直腸癌患者內(nèi)科治療前的常規(guī)檢查。在通常情況下，60％左右的結(jié)直腸癌患者的kras基因是野生型的，如果都接受了Kras基因檢測后，通過個體化的綜合治療方案，在化療基礎(chǔ)上加靶向藥物，有效率可以達(dá)到60％左右，所以越早做Kras基因突變檢測，患者獲益越大。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了很多檢測基因突變的方法：

一、核苷酸序列測定法

核苷酸序列測定法是基因突變經(jīng)典的檢測方法，被譽(yù)為公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，目前國內(nèi)外報(bào)道的發(fā)現(xiàn)的新的基因突變，大多采用DNA測序法，該方法雖然可靠直觀，并可檢測出多位點(diǎn)的變異，但耗時、靈敏度低，尤其在混合模板時，最低檢出極限在10％以上。

二、基因芯片技術(shù)

基因芯片(genechip)，又稱基因微矩陣(microarray)，其原理是將大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作為探針有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等載體上，然后與待測的有熒光標(biāo)記的樣品核酸按堿基配對的原則進(jìn)行雜交，通過激光共聚焦系統(tǒng)檢測雜交信號強(qiáng)度，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析處理數(shù)據(jù)資料，獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，從而可對核酸序列進(jìn)行大規(guī)模、高通量的研究.基因芯片技術(shù)由于其具有大通量、快速、靈敏、平行檢測基因的優(yōu)勢，已在生物學(xué)的各個領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。但由于目前技術(shù)還不夠成熟，所以有一定的假陽性和假陰性率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不容易解釋，不可檢測出新位點(diǎn)的變異。

三、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)方法

錯配PCR結(jié)合RFLP分析技術(shù)能有效地鑒別不同的基因型，實(shí)驗(yàn)簡便、快速，無需特殊儀器，適合于一般實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用及大規(guī)模臨床檢驗(yàn)使用，但靈敏度不夠，且該法操作中需開蓋用PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，增加了產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)造成污染。

四、實(shí)時熒光定量PCR法：

近年來出現(xiàn)的實(shí)時熒光定量PCR(real-time?quantitative?PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，實(shí)驗(yàn)診斷和操作嚴(yán)格的市場準(zhǔn)入制度，基本解決了過去實(shí)驗(yàn)過程因污染出現(xiàn)的假陽性，成為臨床診斷中首選的核酸診斷技術(shù)。