[發明專利]一種快速評估甲型流感病毒宿主特異性的方法

無效

• 申請號: 201010118950.6
• 申請日: 2010-03-05
• 公開（公告）號: CN102192941A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 李錚;孫宇;杜亞蓉;祁會彩;鄧煒娜;王秀榮;楊剛龍
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/28;G01N1/34;G01N1/42;G01N21/64
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1.一種快速評估甲型流感病毒宿主特異性的方法，包括以下步驟：

步驟1：對甲型流感病毒血凝素進行初步純化；

步驟2：制備糖鏈磁性微粒復合物；

步驟3：將初步純化后的甲型流感病毒血凝素與糖鏈磁性微粒復合物進行結合；

步驟4：將與糖鏈磁性微粒復合物結合的甲型流感病毒血凝素進行洗脫；

步驟5：對洗脫后的甲型流感病毒血凝素進行鑒定，根據鑒定結果，以評估甲型流感病毒宿主特異性。

2.根據權利要求1所述的快速評估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于：

所述步驟1中對甲型流感病毒血凝素進行初步純化包括以下步驟；

1)取甲型流感病毒懸液；

2)在甲型流感病毒懸液中加入等體積分析純乙醚；

3)再置于4℃的環境中0.5-2小時，并每隔10min充分振蕩一次；

4)將步驟3)處理后的甲型流感病毒懸液以2000r/min的速度進行10-20min的離心；

5)對離心后的甲型流感病毒懸液進行靜止分層，吸取下層甲型流感病毒懸液，并轉移至另一離心管中；

6)將盛有轉移后的下層甲型流感病毒懸液的離心管置于通風環境中，直至該甲型流感病毒懸液中的乙醚徹底揮發；

7)將步驟6)處理后的甲型流感病毒懸液置于低于-18℃的環境中保存。

3.根據權利要求1所述的快速評估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于：

所述步驟2中制備糖鏈磁性微粒復合物包括以下步驟：

1)取2支離心管，分別放入等量羥基化磁性微粒若干；

2)對羥基化磁性微粒進行磁性分離；

3)對分離后的羥基化磁性微粒棄上清，再用無水乙醇清洗；

4)對無水乙醇清洗后的羥基化磁性微粒再次棄上清，再加入偶聯緩沖液進行清洗；

5)在裝有偶聯緩沖液清洗過的羥基化磁性微粒的2支離心管中，以羥基化磁性微粒的量為參照分別加入20-40μL/mg的偶聯緩沖液；

以羥基化磁性微粒的量為參照，再在其中一個離心管以0.3-0.75μmol/mg加入的SAα2-3Gal糖鏈；另一個離心管以0.3-0.75μmol/mg加入的SAα2-6Gal糖鏈；

6)對2支離心管內的羥基化磁性微粒、偶聯緩沖液以及糖鏈進行混勻；并進行2-10小時的振蕩反應；得到糖鏈磁性微粒復合物；

7)對得到的糖鏈磁性微粒復合物進行磁性分離，棄上清；

8)并用結合緩沖液清洗磁性分離后的糖鏈磁性微粒復合物；

9)清洗完成后，將糖鏈磁性微粒復合物置于保存緩沖液中保存。

4.根據權利要求1所述的快速評估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于：

所述步驟3中將初步純化后的甲型流感病毒血凝素與糖鏈磁性微粒復合物進行結合包括以下步驟：

1)取制備好的上述兩種糖鏈磁性微粒復合物分別放入另外兩個離心管中；

2)以2mL離心管為例，在每個離心管中分別加入200-1000μL結合緩沖液，20-500μL初步純化甲型流感病毒液和1-10μL的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；

3)對混勻后的溶液進行0.5-2小時的振蕩反應，得到結合有甲型流感病毒血凝素的糖鏈磁性微粒蛋白復合物。

5.根據權利要求1所述的快速評估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于：

所述步驟4中將與糖鏈磁性微粒復合物結合的甲型流感病毒血凝素進行洗脫包括以下步驟：

1)對得出的糖鏈磁性微粒蛋白復合物進行磁性分離，棄上清，并用清洗液清洗；

2)將清洗后的糖鏈磁性微粒蛋白復合物加入洗脫液100-1000μL；

3)對加入洗脫液的糖鏈磁性微粒蛋白復合物進行0.1-2h的振蕩反應；

4)對反應后的糖鏈磁性微粒復合物進行磁性分離，獲得上清液，即純化出的甲型流感病毒液血凝素；

5)對純化出的甲型流感病毒液血凝素置于低于-18℃的環境中保存。

6.根據權利要求1所述的快速評估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于，

所述步驟5中對洗脫后的甲型流感病毒血凝素進行鑒定具體是：分別將兩種不同糖鏈磁性微粒復合物純化得到的甲型流感病毒液血凝素進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染顯色，從而評估甲型流感病毒宿主特異性。