[發明專利]黃曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修飾物及其制備方法

無效

• 申請號: 201010117931.1
• 申請日: 2010-03-04
• 公開（公告）號: CN101928704A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 劉國安;沈立民;劉翔;胡芬芬;張弨;張加慧;劉沐榮
• 申請（專利權）人: 杭州北斗生物技術有限公司
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;A61P19/06;C12R1/67
• 代理公司: 杭州金源通匯專利事務所(普通合伙) 33236
• 代理人: 呼保平

技術領域

涉及一種治療痛風和高尿酸血癥的黃曲霉尿酸氧化酶修飾物，尤其涉及一種活性高的黃曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修飾物及其制備方法。?

背景技術

人體嘌呤代謝的最終產物是尿酸，與其他自身表達有活性尿酸氧化酶的物種不同，尿酸不能被進一步氧化分解為容易排除體外的尿囊素。在疾病、遺傳或者飲食等因素的影響下，尿酸會在血液、尿液及組織液中積累，濃度逐漸升高，當超過了其溶解度時，就會增加腎臟負擔，造成腎功能的損傷，特別是長期的尿酸水平升高，會導致尿酸鹽結晶在血流相對不太豐富的關節、皮下組織沉積，形成痛風石。不定期的痛風發作，不但病人非常痛苦，還有可能造成關節畸形、致殘。?

目前治療痛風主要使用抗炎藥物和降尿酸藥物，代表性藥物有秋水仙堿、非甾體抗炎藥、腎上腺皮質激素、別嘌呤醇、丙磺舒、溴苯馬龍等，這些藥物都需要長期服藥，而且具有明顯的副作用。尿酸氧化酶(Urate?Oxidase，UOX)能夠有效分解尿酸為更容易排除體外的尿囊素，其降低尿酸水平的作用方式與其他藥物不同，給藥后迅速發揮降尿酸作用，副作用小。2002年美國食品藥品監督管理局批準原型重組尿酸氧化酶Rasburicase用于治療兒童腫瘤放化療引起的高尿酸血癥。近幾年有尿酸氧化酶用于痛風治療的臨床研究報道，特別是不能耐受別嘌呤醇治療的患者(Rasburicase?for?tophaceus?gout?treatment，Ribeiro?A?et?al，ActaReumatol?Port.2009?Jul-Sep；34(3)：551-4；Urate?oxidase(rasburicase)for?treatment?ofsevere?acute?gout：a?case?report，Wipfler-Freiβmuth?E.et?al，Clin?Exp?Rheumatol.2009Jul-Aug；27(4)：658-660)，取得了很好的治療效果。但是原型重組尿酸氧化酶在體內半衰期短，免疫原性強，限制了其在痛風治療中的應用。?

用聚乙二醇(Polyethlene?glycol，PEG)修飾尿酸氧化酶來降低免疫原性、延長半衰期已有多份報道。中國專利CN1322141A中，發明人對早期的研究作了總結，見說明書第6-8?頁“表1：先前研究中PEG-尿酸氧化酶的特征”。上述表1共總結了14份先前的研究文件，其中采用假單絲酵母來源地尿酸氧化酶的文獻11份，來源于豬肝的尿酸氧化酶的文獻1份，未報道尿酸氧化酶來源的文獻2份。表1所列文獻采用的PEG分子類型包括5KD線形PEG(9份)、2＊5KD分支PEG(3份)以及0.7、7.5、10KD線形PEG各1份。表1所列文獻總體上揭示了PEG修飾活性蛋白質的一股性規律，即隨著PEG修飾程度的增高，所修飾的尿酸氧化酶的活性相對于天然酶活性降低，同時修飾產物的免疫原性降低。但是，上述文獻并沒有揭示出一種技術方案，該技術方案制備的PEG-尿酸氧化酶的剩余酶活性、半衰期、免疫原性能夠滿足臨床用藥的要求。?

在CN1322141A中，發明人公開了修飾的尿酸氧化酶活性保持在原型酶75％以上的修飾方案，PEG的修飾程度(以每個尿酸氧化酶亞基偶聯的PEG分子的數量計)隨不同來源地的尿酸氧化酶、不同分子量的PEG分子而不同。例如，豬-狒狒嵌合UOX，PEG分子量在2-10條/亞基，酶活性均能保持在75％以上，然而，大豆UOX僅在2條/亞基時，才能保持75％以上的活性；對于黃曲霉UOX，當5KD的PEG為12條/亞基或30KD的PEG為7條/亞基，能保持75％以上的活性；對于球形節桿菌UOX，則僅在30KD的PEG為2條/亞基時，才能保持75％以上的活性。發明人的研究結果揭示了一種趨勢，隨著修飾程度的增加，尿酸氧化酶的活性總體上趨于下降。發明人研究結果顯示的另一方面是：大分子量的PEG(10-30KD)相對于小分子量的PEG(5KD)修飾物，能保持更高的活性。發明人的研究結果還顯示，相對于單假絲酵母、黃曲霉、大豆來源地尿酸氧化酶，來源于豬的尿酸氧化酶，尤其是一種豬-狒狒嵌合的尿酸氧化酶，經PEG修飾后能保持更高的酶活性。見圖1-圖5、實施例4-12。?