[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)液泡膜質(zhì)子流的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010117670.3
• 申請(qǐng)日: 2010-03-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101792730A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李銀心;陳顯揚(yáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院植物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/04
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/04;G01N27/333
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)液泡膜質(zhì)子流的方法。

背景技術(shù)

液泡是植物體內(nèi)多功能的細(xì)胞器，在細(xì)胞體積、膨壓、pH和離子平衡的調(diào)節(jié)中起 重要作用。液泡能行使這些功能，源于它能積累高濃度離子的能力。一些離子例如H⁺和 Ca²⁺被認(rèn)為可以強(qiáng)烈影響胞質(zhì)中酶活和大分子物質(zhì)，都被積累于液泡中。因液泡的離子 積累能力，它在調(diào)節(jié)無(wú)機(jī)離子平衡上起著非常重要的作用。

在植物細(xì)胞中，離子平衡主要通過(guò)質(zhì)膜和胞內(nèi)細(xì)胞器膜如液泡膜的離子進(jìn)出調(diào)節(jié) 來(lái)實(shí)現(xiàn)的。從液泡進(jìn)出的離子參與許多的信號(hào)途徑，同時(shí)也起始很多的代謝反應(yīng)。特 別是對(duì)胞質(zhì)中的pH和Ca²⁺信號(hào)的調(diào)控是液泡參與調(diào)控細(xì)胞離子平衡的典型例子。在煙 草的懸浮細(xì)胞中，液泡會(huì)隨著胞質(zhì)中H⁺的升高而降低液泡內(nèi)的pH值來(lái)調(diào)節(jié)胞質(zhì)的pH。 另外，液泡膜上有很多轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，例如Ca²⁺-ATPase和Ca²⁺/H⁺-antiporter，他們可以 催化Ca²⁺進(jìn)入液泡，從而通過(guò)控制液泡上的慢通道和通道介導(dǎo)的液泡Ca²⁺流來(lái)調(diào)控胞質(zhì) 的離子平衡。

盡管已經(jīng)給出很多液泡參與調(diào)控胞質(zhì)離子平衡的證據(jù)，但是對(duì)于特異的H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)和 H⁺流的研究還是很少。當(dāng)植物細(xì)胞遭受多變的外部環(huán)境時(shí)，液泡和細(xì)胞質(zhì)H⁺庫(kù)里的H⁺發(fā)生瞬時(shí)的分配變化，該過(guò)程影響了許多基因功能實(shí)現(xiàn)，同時(shí)引發(fā)了許多的信號(hào)反應(yīng)。

掃描離子選擇電極技術(shù)(SIET)是一項(xiàng)電生理技術(shù)，可以用電腦控制，非損傷地 對(duì)樣品進(jìn)行離子和分子的特異活性監(jiān)測(cè)。迄今為止，很多離子和分子的感受器，例如 Ca²⁺，H⁺，K⁺，Cl^-，NO^-，Mg²⁺，Cd²⁺，Al³⁺等離子和O₂分子的電極感受器，都已經(jīng)研究 完成。不同于其他電生理技術(shù)，比如膜片鉗，SIET有許多優(yōu)點(diǎn)：第一，SIET對(duì)于研究 者來(lái)說(shuō)容易操作。第二，SIET由于非損傷特點(diǎn)，測(cè)定樣品更加準(zhǔn)確。第三，SIET能從 組織，器官，細(xì)胞團(tuán)，單細(xì)胞和細(xì)胞器中測(cè)定離子和分子流。第四，SIET不僅能從離 子通道，而且也能從轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通道和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通道收集電流變化的數(shù)據(jù)。第五， SIET在測(cè)定時(shí)候，清楚地顯示微電極位置和測(cè)定數(shù)據(jù)，全過(guò)程都是可見(jiàn)測(cè)定。

近年來(lái)，SIET技術(shù)已經(jīng)在許多關(guān)于組織和細(xì)胞跨膜離子流研究。在鹽脅迫下，用 SIET測(cè)定楊樹(shù)根Na⁺和H⁺流；另外，通過(guò)根中Ca²⁺離子流測(cè)定，證明根中Ca²⁺離子影響 K⁺/Na⁺離子平衡。此外，通過(guò)SIET，揭示了云杉花粉管中鈣調(diào)素調(diào)控Ca²⁺離子流的作 用模式；同樣地，利用SIET技術(shù)測(cè)定毛白楊花粉管細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)鈣離子內(nèi)流與肌動(dòng)蛋白 絲組織之間的偶聯(lián)關(guān)系，深入地闡述了NO介導(dǎo)的細(xì)胞壁構(gòu)成的機(jī)理。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種提取植物液泡的方法。

本發(fā)明所提供的提取植物液泡的方法，包括如下步驟：

提取并裂解植物葉片的原生質(zhì)體，得到所述植物葉片的原生質(zhì)體裂解溶液，分離 純化所述植物葉片的原生質(zhì)體裂解溶液，得到所述植物的液泡提取液；

所述分離純化所述植物葉片的原生質(zhì)體裂解溶液的方法包括如下密度梯度離心 步驟：將所述植物葉片的原生質(zhì)體裂解溶液加入到8％Ficoll-400溶液的上層，所述 8％Ficoll-400溶液在下層，所述植物葉片的原生質(zhì)體裂解溶液在上層，以500g-50000 g的離心力離心10min-50min，收集上數(shù)第一層溶液，即為所述植物的液泡提取液；

每1升所述8％Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的：將25mmol?Tris、(0.4 -1)mol甘露醇和80g相對(duì)分子重量為400000的聚蔗糖混合，用水定容至1升，再 用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5，得到1升所述8％Ficoll-400溶液。