[發明專利]一種人類和哺乳動物細胞游離表達載體

無效

• 申請號: 201010116202.4
• 申請日: 2010-02-24
• 公開（公告）號: CN101781662A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發明（設計）人: 王天云;董衛華;井長勤;張俊河;王芳;張秀華;張繼紅;李琴
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K48/00
• 代理公司: 新鄉市平原專利有限責任公司 41107
• 代理人: 毋致善

技術領域：

本發明涉及一種DNA，特別是一種人類和哺乳動物細胞游離表達載體。

背景技術：

基因治療技術是隨著DNA重組技術的成熟而逐漸發展起來的，是當代醫學和生物學的一個新的研究領域。基因治療是通過一定方式將正常基因或有治療作用的DNA序列導入靶細胞以糾正基因的缺陷而發揮治療作用，從而達到治療疾病的目的。自從20世紀90年代初首次成功進行基因治療的臨床試驗以來，迄今已完成了數千例基因治療臨床試驗。作為一種分子藥物治療形式，基因治療為許多遺傳性和獲得性疾病提供一種新的治療方式。從早期單基因遺傳病的治療，目前已擴展到對人類健康威脅嚴重的多基因疾病，包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病，以及感染性疾病(如AIDS、乙型肝炎)等。

載體(vector)是將外源基因導入宿主細胞的運載工具。基因治療載體系統包括病毒與非病毒兩種。目前大多數臨床基因治療仍采用轉染率較高的病毒載體，外源基因整合到宿主的染色體上，存在著潛在的致癌性、自身免疫原性和/或造成細胞病理改變等。和病毒載體相比，非病毒載體雖然有很多優點，但其轉染效率低，持續表達時間短，大多為瞬時表達，如要穩定持久地表達，載體必須整合到宿主細胞染色體上，載體的隨機整合會引起插入突變或導致轉基因的沉默。此外，目前所用的基因治療表達載體都包含原核質粒的序列，如在大腸桿菌中起復制起始作用的DNA序列、在細菌中篩選陽性克隆的抗藥性基因標志等，這些DNA序列便于插入真核基因后能在大腸桿菌系統中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復制繁殖得到足夠使用的數量。但是這些原核質粒序列在真核宿主細胞并不具備任何功能，并且基因治療導入宿主細胞后對患者存在潛在的危險，如由于抗藥性抗性基因失控導致的隨機分布、某些未知表達信號激活等。因此，構新型、高效、安全的基因治療表達載體，是基因治療中亟待解決的問題。

發明內容：

本發明的目的是提供一種安全性能好、效率高的人類和哺乳動物細胞游離表達載體。本發明的技術方案是，其特征在于：所述載體的多克隆位點下游和上游分別含有人源性的MAR和有治療作用的外源基因DNA片段且只含有真核表達元件的表達載體。此載體可作為基因治療的應用。本發明與現有技術比較具有安全性能好、效率高的顯著優點。

附圖說明：

圖1是pEGFP-C1初始載體結構圖，載體購自clontech公司，其上帶有啟動子CMV和EGFP基因。

圖2使中間載體pEMW構建流程圖，其中MCS位點含有BglII、XhoI、SacI、HindIII、EcoRI、PstI、SalI(AccI)、KpnI(Asp7181)、SacII、ApaI(Bsp1201)、XmaI、SmaI、BamHI。

圖3是游離性表達載體pEVW的構建流程圖，其中MCS位點含有BglII、XhoI、SacI、HindIII、EcoRI、PstI、SalI(AccI)。

圖4是pEVWN載體的結構圖，HindIII/SalI酶切pEVW及β-hNGF基因片段，連接，載體大小為6919bp。

具體實施方式：

pEGFP-C1載體為人類及哺乳動物細胞的表達載體，其上含有增強型綠色熒光蛋白(Enhance?green?fluorescent?protein?gene，EGFP)基因，EGFP基因為報告基因，其主要作用是為了在宿主細胞中容易檢測目的基因的表達。因此本發明中首先將EGFP基因刪除，替換為一段新合成的含CMV啟動子和多克隆位點(multiple?cloning?site，MCS)的DNA序列。此外，pEGFP-C1載體含有kan/Neo篩選標記及原核表達調控元件，這些篩選標記及原核表達調控元件在載體的克隆、篩選具有重要作用，但基因治療導入宿主細胞后對患者存在潛在的危險因素。因此，本發明引入了一個新的ClaI酶切位點，使構建的pEVW載體具備2個相同的ClaI酶切位點。在載體構建、克隆完成后，利用ClaI酶切位點酶切pEVW載體，刪除原核質粒元件，然后用T4DNA連接酶連接，純化后用于人類的基因治療。

結合以下實施例具體說明本發明所述載體pEVW的構建過程與應用。

本發明實施例中所使用的質粒載體pEGFP-C1(質粒圖譜如圖1所示)購自clontech公司，所使用的菌株E.coli?DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司，所使用的試劑均為市售商品。

實施例1：中間載體pEMW構建