[發(fā)明專利]表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010115437.1
• 申請日: 2010-03-01
• 公開（公告）號: CN102191207A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉雯;黃靜;李娟;勞勛;肖磊;吳自榮
• 申請（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/12;C12N15/70;C12P21/06;C12P21/02;A61K38/18;A61P3/10;A61P3/06;C12R1/19
• 代理公司: 上海麥其知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌包括攜帶重組質(zhì)粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21的大腸桿菌DH5α，以及同時攜帶重組質(zhì)粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21和質(zhì)粒pTf16-P_araB-tig的大腸桿菌BL21(DE3)；其中，所述重組質(zhì)粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21中的P_T7lac是質(zhì)粒pET32a(+)的啟動子，TrxA是硫氧還蛋白，6×His是組氨酸純化標(biāo)簽；所述質(zhì)粒pTf16-P_araB-tig中的P_araB是質(zhì)粒pTf16的啟動子。

2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：

第一步FGF-21?DNA序列的擴(kuò)增

以含有FGF-21?DNA序列，即SEQ?ID?NO.1序列的重組質(zhì)粒作為模板；

設(shè)計引物，引物為：

F1：5’GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC3’，即SEQ?ID?NO.2序列；

F2：5’ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG3’，即SEQ?ID?NO.3序列；

通過PCR擴(kuò)增獲得FGF-21?DNA序列，同時在該序列兩端引入酶切位點Bgl?II和EcoR?I；

第二步構(gòu)建含F(xiàn)GF-21?DNA序列的基因工程菌

用限制性內(nèi)切酶Bgl?II和EcoR?I分別雙酶切所述第一步獲得的FGF-21?DNA片段和質(zhì)粒pET32a(+)，分別純化回收大片段，并將其連接，得到含F(xiàn)GF-21?DNA片段的重組質(zhì)粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21；

將所述重組質(zhì)粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，構(gòu)建含F(xiàn)GF-21?DNA序列的基因工程菌；

第三步構(gòu)建可溶性表達(dá)FGF-21的基因工程菌

將質(zhì)粒pTf16-P_araB-tig和重組質(zhì)粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，獲得表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌。

3.一種用權(quán)利要求1所述的基因工程菌生產(chǎn)FGF-21的方法，其特征在于，步驟如下：

第一步液體培養(yǎng)

將所述表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；然后，將培養(yǎng)所得菌液按比例轉(zhuǎn)接入乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；最后離心收集菌體；

第二步純化制備FGF-21融合蛋白

將第一步中收集的菌體用IDA-0緩沖液重懸，超聲破碎后，離心收集上清，進(jìn)行鎳離子親和層析，收集FGF-21融合蛋白；其中，所述IDA-0緩沖液的組成包括：Tris-HCl(pH7.4)20mM，0.5M?NaCl；

第三步制備FGF-21

用腸激酶酶解以上所得的FGF-21融合蛋白，經(jīng)裂解后，再次進(jìn)行鎳離子親和層析，收集含F(xiàn)GF-21的組分，并用超濾管將其脫鹽和濃縮，得到產(chǎn)物FGF-21。

4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)FGF-21的方法，其特征在于，所述乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方包括：胰蛋白胨0.25-4％，酵母提取物0.125-2％，NaCl?0.125-2％，Na₂HPO₄?12.5-200mM，KH₂PO₄?12.5-200mM，(NH₄)₂SO₄?6.25-100mM，MgSO₄?0.5-8mM，甘油0.125-2％，葡萄糖0.0125-0.2％，乳糖0.05-0.8％。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌表達(dá)的FGF-21，在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物活性成分的應(yīng)用。