[發(fā)明專利]魚肉制品中安康魚種源的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010114302.3
• 申請日: 2010-02-26
• 公開（公告）號: CN102168127A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設計）人: 劉暢
• 申請（專利權(quán)）人: 劉暢
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于魚肉制品中物種來源鑒定的檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測食品中安康魚的快速檢測方法。

背景技術(shù)

海洋捕撈的海洋大型魚類一直是世界各國人民喜愛的食品，也是國際貿(mào)易的重要商品種類。海洋大型魚類在貿(mào)易中常常包括加工成魚肉片或者魚肉塊，更包括一些魚的內(nèi)臟或者其他深加工的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品從外觀上已經(jīng)不能看出用來加工的原料魚種類，因此需要不受外觀和加工工藝的限制來確認商品的真?zhèn)巍?/p>

基于DNA的檢測方法可以從基因水平進行物種鑒定。實時熒光PCR法以其操作簡便、靈敏、特異、快速、重復性好、定量準確、全封閉反應等優(yōu)點，得到研究者的普遍認可，成為基因檢測和鑒定的重要工具。目前國內(nèi)外還沒有對安康魚物種的鑒定方法公開，本發(fā)明可彌補上述缺陷，完成魚肉制品中安康魚種源的鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明屬于魚肉制品中物種來源鑒定的檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測食品中安康魚的快速檢測方法。克服基于形態(tài)學的檢測方法在魚類產(chǎn)品加工過程中帶來的鑒定困難，為確定安康魚的種源提供技術(shù)手段，從而確保食品標簽的一致性。

本發(fā)明的主要原理為：針對保守序列設計一組引物：上游引物AnkangF106：5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3；下游引物AnkangR106：5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。利用裂解液破碎細胞，三氯甲烷抽提蛋白質(zhì)，異丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA為模板進行PCR擴增；測定熔解曲線時，在反應體系中加入熒光染料Eva?Green，染料與DNA雙鏈結(jié)合并發(fā)出熒光，由于反應中存在少量的非特異聚合體(如引物二聚體等)，能引起干擾，但非特異聚合體的熔解溫度較特異性結(jié)合低，當擴增結(jié)束后，再緩慢加溫，當DNA變性后，染料被釋放，熒光減少，而非特異性結(jié)合先于特異性結(jié)合減少，對熔解過程進行連續(xù)動態(tài)監(jiān)測可得熔解曲線，通過曲線將非特異性訊號和特異性訊號區(qū)分出來，同時對特異性訊號區(qū)，熒光減少的快慢與濃度的對數(shù)成正比，以此可以確定是否有引物特異性擴增產(chǎn)物。

本發(fā)明涉及的安康魚種源快速檢測方法，其中的試劑包括如下：

(1)PCR擴增反應液

包括10×PCR反應緩沖液、0.1-0.4mmol/L?dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、1-2U?Taq酶、0.2-0.6μmol/L上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、1.25μL?20×Eva?Green染料(美國Biotum公司)；

其中10×PCR反應緩沖液含有100mmol/L?pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1％曲拉通X-100；

上游引物AnkangF106：5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3；下游引物AnkangR106：5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。其中上游引物、下游引物體積比為：1∶1；

使用上述試劑盒檢測食品中安康魚種源的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)：

(1)待檢樣品DNA的提取

DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。DNA提取質(zhì)量使用OD₂₆₀和OD₂₈₀的光吸收來衡量，或者使用其他方法衡量。

(2)安康魚種源的實時熒光PCR擴增

A.在裝有24μL?PCR擴增反應液A的反應管中加入1μL待檢樣品DNA，混勻。

B.檢測過程中分別設陽性對照、空白對照。使用具有溯源性的陽性標準物質(zhì)作為陽性對照，用已知不含魚類成分的樣品作陰性對照，用等體積的水代替模板DNA作空白對照。

C.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增：

94-95℃??2-4min，1個循環(huán)；

94-95℃??30s，65℃?30s，75℃?30s，共45個循環(huán)；

95℃?15s，60℃?15s，20min內(nèi)升溫至95℃，95℃?15s。

(3)使用熔解曲線分析PCR擴增結(jié)果。

非安康魚樣品：熔解曲線在81±0.5℃無單一峰；安康魚樣品：熔解曲線在81±0.5℃有單一峰。

本發(fā)明建立了安康魚種源的實時熒光PCR檢測方法及檢測方法。本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)，該技術(shù)特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用于一些成分復雜的魚肉制品中安康魚種源的檢測。

附圖說明