[發(fā)明專利]基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010112452.0
• 申請(qǐng)日: 2010-02-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101788484A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王亞云;楊雁靈;季茹;李俊杰;千年松;武勝昔;李云慶;魏燕燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬(wàn)壽

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于激光共聚焦成像領(lǐng)域，涉及一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法。

背景技術(shù)：

氯離子是機(jī)體內(nèi)最豐富的陰離子。調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度的氯通道廣泛存在于機(jī)體的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜。氯通道在細(xì)胞多種活動(dòng)和調(diào)節(jié)過(guò)程如細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞興奮性調(diào)節(jié)、pH調(diào)節(jié)、容量調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用。因此，氯離子穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞各項(xiàng)代謝活動(dòng)的必要條件，一旦氯離子穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞就會(huì)受到功能性或器質(zhì)性損害甚至死亡。

激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)是近年推出的集激光技術(shù)、電子技術(shù)、光學(xué)設(shè)計(jì)及計(jì)算機(jī)于一體的影像檢測(cè)儀。其特點(diǎn)是照明點(diǎn)和探測(cè)點(diǎn)共軛，具有高分辨率和深度識(shí)別能力，可對(duì)生物樣品(腦組織切片、活細(xì)胞等)進(jìn)行無(wú)損傷光切，并可通過(guò)三維重建，得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu)。它的另一個(gè)重要的特點(diǎn)是可實(shí)時(shí)觀察活組織切片及細(xì)胞內(nèi)各種離子的動(dòng)態(tài)變化。利用激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)觀察腦片或者單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)氯離子濃度的變化是新的細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度檢測(cè)方法，能夠可視化檢測(cè)不同區(qū)域、不同細(xì)胞的氯離子濃度水平。

在過(guò)去的二、三十年中，氯測(cè)定一直局限于電生理學(xué)方法，無(wú)法進(jìn)行可視化檢測(cè)。現(xiàn)在，由于指示劑選擇和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)方面都獲得了快速的發(fā)展，細(xì)胞內(nèi)氯成像探針(縮寫(xiě)MQAE，全稱為N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium?bromide)的研發(fā)成功使得氯離子測(cè)定成為可能。但是，如何針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定細(xì)胞(主要是神經(jīng)元)進(jìn)行氯離子濃度測(cè)定、如何可視化細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度、如何實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)氯離子濃度變化情況，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本技術(shù)的建立將為揭開(kāi)氯離子生理和病理作用的奧秘提供支持，并為人類認(rèn)識(shí)和最終戰(zhàn)勝由氯離子穩(wěn)態(tài)失衡造成的臨床疾病提供線索。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明為一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法。

本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)3個(gè)可能：使針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定細(xì)胞(主要是神經(jīng)元)進(jìn)行氯離子濃度測(cè)定成為可能、使細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度可視化成為可能、使實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)氯離子濃度變化情況成為可能。

針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明要解決的技術(shù)難題主要是兩個(gè)：第一，如何向中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定細(xì)胞導(dǎo)入氯成像探針MQAE，并保證該探針工作正常；第二，如何利用激光共聚焦顯微鏡記錄細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度信號(hào)，并保證該結(jié)果真實(shí)有效。

為此，本發(fā)明提供一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法，按照如下步驟：(1)腦片與氯離子熒光探針MQAE共孵育；(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄；(3)校正細(xì)胞內(nèi)氯離子熒光探針MQAE熒光值。

所述步驟(1)是指：將厚度為200～300微米的腦片平置于細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板內(nèi)預(yù)先放置的圓形蓋玻片上。圓形蓋玻片在使用前經(jīng)濃度為1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液包被，使之易于細(xì)胞貼附。用通入混合氣體的中性緩沖液，稱之為Krebs-HEPES緩沖液，洗滌除去雜質(zhì)，要求洗3次，每次5分鐘。再將終濃度為5毫摩爾的氯成像探針(縮寫(xiě)MQAE，全稱為N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium?bromide)少許(100～200微升)加入每個(gè)孔中，要求夠夠覆蓋住全部腦片。然后在溫度設(shè)置為37℃的恒溫培養(yǎng)箱(最好使用專用細(xì)胞培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)1小時(shí)左右，不要超過(guò)2個(gè)小時(shí)。在此期間，將氧氣和二氧化碳?xì)馔瑫r(shí)注入另外的新鮮配制的中性緩沖液(Krebs-HEPES緩沖液)中。待培養(yǎng)結(jié)束后，用此緩沖液再次洗滌腦片，以除去細(xì)胞外殘余的氯成像探針(MQAE)(要求洗滌3到5次，每次不超過(guò)5分鐘)。之后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

所述步驟(2)是指：首先在激光共聚焦顯微鏡成像前，準(zhǔn)備中性緩沖液(Krebs-HEPES緩沖液)，要預(yù)先通入濃度為95％的氧氣和濃度為5％的二氧化碳?xì)狻Ｈ缓髮⒕彌_液經(jīng)實(shí)驗(yàn)用輸液管勻速輸入灌流槽中，灌流速度不能超過(guò)1.5到2.0毫升每分鐘。再將此灌流槽放置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上。這時(shí)，將步驟(2)所得腦片浸入灌流槽內(nèi)。用顯微鏡的目鏡選定所需要的部位。開(kāi)啟共聚焦顯微鏡紫色半導(dǎo)體激光器，經(jīng)過(guò)顯微鏡上分光鏡過(guò)濾得到波長(zhǎng)為405納米的紫外光。該束紫外光經(jīng)顯微鏡的物鏡聚焦后，能夠激發(fā)腦片上的特殊細(xì)胞(神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的重要細(xì)胞，稱為神經(jīng)元)內(nèi)的氯成像探針MQAE。氯成像探針MQAE被激發(fā)后發(fā)出波長(zhǎng)為440納米的發(fā)射光，此發(fā)射光沿同一光路進(jìn)入物鏡，穿過(guò)分光鏡后在探測(cè)針孔處成像，后經(jīng)光電倍增管接收、放大后迅速在計(jì)算機(jī)顯示屏上形成熒光圖像。共聚焦顯微鏡以電信號(hào)的形式記錄圖像后，通過(guò)自帶軟件進(jìn)行圖像處理，最后獲得氯成像圖片。