[發明專利]具有高產D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖異構酶的突變體酶L20A及其突變方法

無效

• 申請號: 201010112337.3
• 申請日: 2010-02-20
• 公開（公告）號: CN101768581A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 江波;沐萬孟;程麗芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12P19/02
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種具有高產D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖異構酶的突變體酶及 其突變方法，以及利用該突變體酶生產D-塔格糖的技術，屬于生物工程、基因 工程和酶工程技術領域。

背景技術

D-塔格糖是近年發現的一種具有特殊保健功能的功能性甜味劑。D-塔格糖 屬于天然稀有糖的一種，在許多食品中都發現少量存在，如高溫滅菌牛奶、奶 酪、酸奶及其它奶制品等。2000年美國食品與藥物管理局(FDA)確定D-塔格 糖為普遍公認安全食品(GRAS)，并正式批準作為甜味劑用于食品飲料業以及 醫藥制劑中；隨后聯合國糧農組織和世界衛生組織的聯合食品添加劑委員會第 57次會議批準D-塔格糖作為食品添加劑；歐盟也于2003年批準D-塔格糖在歐 洲上市。

目前，國內對于D-塔格糖生產的研究還處于起步階段，國外對其研究已較 為深入，方法主要有兩種：化學法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化 學法生產的。由于一方面化學法生產存在許多不利因素，如化學污染物多，堿 性條件下異構化反應副產物多，分離困難等；另一方面由于消費者消費觀念的 轉變，天然食品的需求日益增長，因此近年來對D-塔格糖生產的研究集中在生 物法上。

研究發現L-阿拉伯糖異構酶(EC?5.3.1.4，縮寫為L-AI)可以催化D-半乳糖 轉化為D-塔格糖，是目前生物法生產D-塔格糖最為有效的途徑。但是L-AI是一 種非專一性酶，它可以分別催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖為L-核酮糖和D-塔格糖。 研究表明L-AI催化L-阿拉伯糖的效率明顯高于D-半乳糖。本發明所使用的來源 于(Acidothermus?cellulolytics)ATCC?43068的L-AI酶是一種高耐熱性酶，具有 工業應用前景。因此，進一步提高該酶催化D-半乳糖轉化生產D-塔格糖的能力 將賦予其更好的應用潛能。

發明內容

本發明的一個目的是：提供提高來源于解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC?43068的L-AI酶產D-塔格糖能力的方案。

本發明的另一個目的是：提出具有更高生產D-塔格糖能力的單突變體酶 L20A，及其構建方法。

同時本發明還提供了一種利用該單突變體酶L20A生產D-塔格糖的方法。

本發明的技術方案：一種L-可拉伯糖異構酶的單突變體酶L20A，將來源于 解纖維熱酸菌(Acidothermus?cellulolytics)ATCC?43068的L-阿拉伯糖異構酶 L-AI酶(其基因序列詳見Appl?Microbiol?Biotechnol?DOI 10.1007/s00253-009-2322-z)，進行突變所得的單突變體酶L20A；其為L-AI酶 基因中第20位的亮氨酸Leu突變成了丙氨酸Ala，命名為L20A；它相比于野生 型L-AI酶具有更高的產D-塔格糖的能力。

所述的L-阿拉伯糖異構酶的單突變體酶L20A的制備方法，根據ATCC 43068的L-AI酶基因序列，設計突變引物，對L-AI酶進行定點突變，測定DNA 序列，鑒定出第20位Leu密碼子突變成Ala密碼子，并將其表達于大腸桿菌中， 經誘導即得L-阿拉伯糖異構酶的單突變體酶L20A；步驟為：

(1)定點突變

利用重疊延伸PCR技術，以表達載體pET-22b(+)-araA為原始模版，經 PCR1，PCR2及PCR3，引入L20A突變點，定點突變的引物為：

上游外側引物：5’-TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3’，

下游外側引物：5’-TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3’，

正向突變引物：5’-CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3’，下劃線為突變堿基，

反向突變引物：5’-CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3’，下劃線為突變堿基，

PCR1反應體系為：10×PCR?buffer?5μL，2mM?dNTP?4μL，10μM上游外側 引物1μL，10μM反向突變引物1μL，模版DNA?1μL，5U/mL?taq?plus?0.5μL， 加入雙蒸水至50μL。