[發明專利]一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法

有效

• 申請號: 201010112281.1
• 申請日: 2010-02-23
• 公開（公告）號: CN101788483A
• 公開（公告）日: 2010-07-28
• 發明（設計）人: 楊雁靈;王亞云;季茹;李俊杰;千年松;武勝昔;魏燕燕
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域：

本發明屬于激光共聚焦成像領域，涉及一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神 經系統氯成像方法。

背景技術：

氯離子是機體內最豐富的陰離子。調控細胞內外氯離子濃度的氯通道廣泛存在于機體 的細胞膜和細胞器膜。氯通道在細胞多種活動和調節過程如細胞增殖、凋亡、細胞興奮性 調節、pH調節、容量調節和免疫應答中均發揮重要作用。因此，氯離子穩態是維持細胞各 項代謝活動的必要條件，一旦氯離子穩態被破壞，細胞就會受到功能性或器質性損害甚至 死亡。

激光共聚焦掃描顯微鏡系統是近年推出的集激光技術、電子技術、光學設計及計算機 于一體的影像檢測儀。其特點是照明點和探測點共軛，具有高分辨率和深度識別能力，可 對生物樣品(腦組織切片、活細胞等)進行無損傷光切，并可通過三維重建，得到樣品的三 維立體結構。它的另一個重要的特點是可實時觀察活組織切片及細胞內各種離子的動態變 化。利用激光共聚焦掃描顯微鏡系統觀察腦片或者單個神經元內氯離子濃度的變化是新的 細胞內氯離子濃度檢測方法，能夠可視化檢測不同區域、不同細胞的氯離子濃度水平。

在過去的二、三十年中，氯測定一直局限于電生理學方法，無法進行可視化檢測。現 在，由于指示劑選擇和監測系統方面都獲得了快速的發展，細胞內氯成像探針(縮寫 MQAE，全稱為N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium?bromide)的研發成功使得 氯離子測定成為可能。但是，如何針對外周神經系統內特定細胞(即神經節細胞)進行氯離 子濃度測定、如何可視化細胞內氯離子濃度、如何實時、動態地監測氯離子濃度變化情況， 國內尚未見報道。本技術的建立將為揭開氯離子生理和病理作用的奧秘提供支持，并為人 類認識和最終戰勝由氯離子穩態失衡造成的臨床疾病提供線索。

發明內容：

本發明為一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法。

本發明的目的在于實現3個可能：使針對單個外周神經系統內細胞(主要是神經節細胞) 進行氯離子濃度測定成為可能、使細胞內氯離子濃度可視化成為可能、使實時動態地監測 氯離子濃度變化情況成為可能。

針對以上問題，本發明要解決的技術難題主要是兩個：第一，如何向外周神經系統單 個神經節細胞導入氯成像探針MQAE，并保證該探針工作正常；第二，如何利用激光共聚 焦顯微鏡記錄細胞內氯離子濃度信號，并保證該結果真實有效。

為此，本發明提供了一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方 法，按照如下步驟：

(1)單個神經節細胞與氯離子熒光探針MQAE共孵育；

(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄；

(3)校正單個神經節細胞內氯離子熒光探針MQAE熒光值。

所述步驟(1)是指：將分離得到的外周神經系統單個神經元(即神經節細胞)滴加到細胞 培養用24孔板內預先放置的圓形蓋玻片上。圓形蓋玻片在使用前經濃度為1毫克每毫升 的多聚酪氨酸溶液包被，使之易于細胞貼附。加入終濃度為5毫摩爾的氯成像探針(縮寫 MQAE，全稱為N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium?bromide)少許(100-200 微升)。在溫度設置為37℃的恒溫培養箱(最好使用專用細胞培養箱)中培養20分鐘左右。 在此期間，將氧氣和二氧化碳氣同時注入另外的新鮮配制的中性緩沖液(Krebs-HEPES緩沖 液)中。待培養結束后，用此緩沖液置換神經節細胞探針液，以除去細胞外殘余的氯成像探 針(MQAE)(要求洗1次，5分鐘)。之后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。