[發(fā)明專利]一種檢測基因斷裂融合的方法

無效

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• 申請日: 2010-02-11
• 公開（公告）號: CN101886119A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發(fā)明（設計）人: 王宏偉;覃艷紅;陳秀花;齊喜玲;徐智芳
• 申請（專利權）人: 王宏偉
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 太原市科瑞達專利代理有限公司 14101
• 代理人: 李富元

技術領域

本發(fā)明涉及一種基因發(fā)生斷裂融合的檢測方法，具體地，是涉及到急性髓系白血病相關基因AML1、RARα、MLL等斷裂融合的檢測方法。

背景技術

白血病是源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，染色體異常是白血病發(fā)生的常見原因。染色體導致的分子事件是兩個基因的斷裂融合，如t(15；17)形成PML/RARα融合基因，t(8；21)導致AML1/ETO的形成。融合基因的發(fā)現(xiàn)有助于研究白血病發(fā)生的分子機制并尋找特定的靶向藥物。如PML/RARα導致AML-M3分子機制的闡明，使全反式維甲酸(ATRA)成為治療AML-M3的成功藥物。其它一些染色體異常，盡管其致病機制尚未闡明，但臨床實踐發(fā)現(xiàn)其已成為很好的獨立預后指標。例如：一些染色體異常如inv(16)，t(16；16)，t(8；21)的白血病患者預后較好，另一些染色體異常，包括t(6；9)，t(9；22)，del(5q)和del(7q)則預后較差，而其它染色體異常(如+8、+6、-Y)和無明顯遺傳學異常的病例預后中等。可見基因斷裂融合是白血病發(fā)生的主要原因，特定融合基因異常在白血病的分型診斷、治療及預后判斷方面有重要意義。但是在急性髓系白血病中，常見融合基因斷裂位點存在著復雜性及不同基因間斷裂融合的多樣性，而目前的多種檢測手段均存在著明顯的不足之處。基因融合事件的發(fā)生通常在兩個層面進行檢測，一是細胞遺傳學檢測，即以染色體為主體的顯帶技術及熒光原位雜交技術(Fluorescence?In-Situ?Hybridization，F(xiàn)ISH)，國外常采用FISH方法進行鑒定，但其對于未知染色體異常病例，常需多種探針進行篩選，成本高，周期長，不適合常規(guī)檢測。另外一個是以mRNA為主體的RT-PCR檢測技術，靈敏度較好，是目前融合基因檢測的主要方法，但由于融合基因斷裂位點的多樣性以及“伙伴”基因的復雜性，使得常規(guī)RT-PCR方法無法檢測到全部的易位類型。如欲覆蓋所有融合基因類型，又需設計許多對引物進行多重PCR反應，這樣既浪費時間又增加成本，而且難以檢測到新的未知基因的斷裂融合。

發(fā)明內容

本發(fā)明旨在克服上述已有技術的不足，提供一種快速、有效的檢測基因斷裂融合的方法。

鑒于融合基因的多樣性和復雜性以及現(xiàn)有檢測手段的不足，經分析比較了大量已報道的融合基因斷裂位點，發(fā)現(xiàn)：雖然AML1、RARα和MLL等基因可以與不同的“伙伴”基因及相同“伙伴”基因的不同斷裂位點形成許多種不同的融合基因，但是它們自身的斷裂位點卻是相對恒定的。例如，與AML1相關的染色體易位AML1基因斷裂點恒定地發(fā)生在第5、6內含子，與RARα相關的染色體易位RARα基因斷裂點恒定地發(fā)生在第2內含子，與MLL相關的染色體易位MLL基因斷裂點恒定地發(fā)生在第5-9內含子之間。本發(fā)明即將這一發(fā)現(xiàn)作為基礎進行基因斷裂融合事件的檢測。

本發(fā)明以AML1基因為例介紹相關的發(fā)明內容。本發(fā)明方法是：

(1)基因的恒定斷裂位區(qū)域設為Breakpiont區(qū)，簡稱B區(qū)；恒定表達區(qū)設為Control區(qū)，簡稱C區(qū)。兩區(qū)相對表達量之比稱為B/C比值。

(2)使用引物設計軟件primer5.0在AML1基因的mRNA上的恒定斷裂位點B區(qū)與恒定表達區(qū)C區(qū)設計引物及探針。AML1斷裂融合發(fā)生在exon5或exon6之后，故B區(qū)引物需分別設計在exon5和exon7內。C區(qū)應在斷裂區(qū)5’側選擇，故在跨exon3和exon4區(qū)域設計。B區(qū)和C區(qū)片段大小接近、退火溫度一致，使其可在同一條件下擴增，擴增效率盡可能一致。

(3)熒光定量PCR方法檢測AML1基因B區(qū)與C區(qū)擴增產物量，由兩區(qū)相對表達量之比(即B/C比值)判斷是否發(fā)生融合事件。理論上，對于二倍體細胞來講，B/C比值＞0.5且＜1.0，認為AML1基因發(fā)生了斷裂融合，但實際上由于初發(fā)白血病細胞數(shù)量、實驗操作手法、PCR的敏感性等問題的影響，B/C比值會和理論上有所區(qū)別。經大樣本統(tǒng)計分析，正常對照組B/C比值位于0.7260-1.51之間，因此我們設B/C比值低于0.60作為篩選標準，即：B/C比值低于0.60視為AML1基因發(fā)生了斷裂融合。以0.60作為篩選標準，可能會漏選一些可疑病例，但可以優(yōu)先篩選出最可疑AML1基因發(fā)生斷裂融合的病例。

(4)采用RACE(Rapid?amplification?of?cDNA?ends)方法結合克隆測序進行新的融合基因斷裂位點的鑒定。

對于篩選出的可疑的基因發(fā)生斷裂融合的病例，采用RACE方法結合克隆測序進行新的融合基因斷裂位點的鑒定，可尋找到新的“伙伴”基因。