[發(fā)明專利]一種利用大腸桿菌表達煙草富含甘氨酸RNA結合蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010110901.8
• 申請日: 2010-02-21
• 公開（公告）號: CN101824429A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發(fā)明（設計）人: 李文正;陳禹保;劉勇;陳學軍;盧秀萍;唐啟慧
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/29;C12N1/21;C07K14/415
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用大腸桿菌表達煙草富含甘氨酸RNA結合蛋白的方法，包括表達菌株篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、蛋白提取緩沖液配制，其特征在于：具體包括下列工序：

A、提取煙草總RNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增出GRP蛋白基因；

B、構建重組表達質(zhì)粒pGEX4T-1-GRP；

C、轉化大腸桿菌表達菌株、小量誘導篩選高效表達菌株、大量誘導表達；用陽性pGEX4T-1-GRP質(zhì)粒轉化的大腸桿菌表達菌rosetta，涂培養(yǎng)基LinA平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)約15小時至長出單克隆，用牙簽挑10個克隆菌株分別做好標記，各克隆菌株的一半分別放入2ml培養(yǎng)基LinA中，于37℃搖約4-5小時至OD₆₀₀＝0.5，每管取出200μl作為陰性對照，剩余加終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，于37℃下誘導兩小時后所有管取200μl，同兩小時前取出的陰性對照一起SDS-PAGE；選擇表達量最好的克隆，從板上挑剩余的一半接種入100ml培養(yǎng)基LinA中，于37℃振搖培養(yǎng)15小時；按1∶100轉接入1L培養(yǎng)基LinA中，搖約2小時至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG于37℃下誘導，2小時后離心收集菌體，并用緩沖液10xA洗一次，沉淀物冷凍于-80℃冰箱中備用；

所述的培養(yǎng)基LinA由8-12g的胰蛋白胨Trypton、1-3g的酵母抽提物Yeast?extracts、4-6g的氯化鈉NaCl、80-120ml的緩沖液10xA和1000ml雙蒸水配制而成；所述的培養(yǎng)基LinA使用前加入經(jīng)過濾除菌的濃度0.5％的葡萄糖；

所述的緩沖液10xA由380-420mM的K₂HPO₄、150-250mM的KH₂PO₄、70-90mM的(NH₄)₂SO₄和16-20mM的Sodium?Citrate配制而成；

D、蛋白提取；將誘導表達收集的菌體從-80℃冰箱取出置于冰上或4℃冰箱中約半小時至溶化；按質(zhì)量體積比1∶10的比例加入緩沖液TKM，渦旋震蕩混勻，加入100倍的苯甲基磺酰氟化物PMSF、溶菌酶、1000倍的二巰基蘇糖醇DTT后于冰上磁力攪拌半小時；然后再加入PMSF、DTT，于180HZ超聲波間?歇破碎1min，最后加脫氧核糖核酸酶DNase消化10min，于12000rpm離心分離40min，上清液加入PMSF和DTT，即可上純化柱體純化蛋白；所述的緩沖液TKM由8-12mM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液Tris-HCl、40-60mM氯化鉀KCl、8-12mM的醋酸鎂Mg(AC)₂配制而成；

E、蛋白活性鑒定。

2.如權利要求1所述的一種利用大腸桿菌表達煙草富含甘氨酸RNA結合蛋白的方法，其特征在于：所述的A工序，系按試劑盒載明的技術規(guī)范進行，根據(jù)GenBank中GRP基因序列，設計出針對GRP基因的引物，提取總RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下逆轉錄出GRP基因cDNA?1st-Stand；再設計引物，以逆轉錄出的1st-Stand為模板PCR擴增cDNA，PCR結束后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化后的克隆至增殖載體pMD20-T中，熱激法轉化大腸桿菌普通增殖感受態(tài)細胞DH5α，PCR鑒定，能PCR出正確大小基因片段的陽性質(zhì)粒送測序。

3.如權利要求1所述的一種利用大腸桿菌表達煙草富含甘氨酸RNA結合蛋白的方法，其特征在于：所述的B工序，系根據(jù)GRP基因陽性重組質(zhì)粒的測序結果，通過上下游加入酶切位點和保護堿基設計引物，以GRP基因陽性重組質(zhì)粒pMD20-T-GRP為模板進行PCR，擴增出兩端帶有酶切位點和保護堿基的GRP基因序列；經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化后雙酶切，與用同兩種酶雙酶切的pGEX4T-1載體連接、熱激法轉化大腸桿菌普通增殖感受態(tài)細胞DH5α、挑單克隆菌株擴大培養(yǎng)，PCR鑒定，能PCR出正確大小基因片段的陽性質(zhì)粒送測序。

4.如權利要求1所述的一種利用大腸桿菌表達煙草富含甘氨酸RNA結合蛋白的方法，其特征在于：所述的E工序，純化蛋白采用常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA和蛋白印跡法western?blotting進行鑒定。

5.如權利要求1所述的一種利用大腸桿菌表達煙草富含甘氨酸RNA結合蛋白的方法，其特征在于：所述的溶菌酶用蛋白提取緩沖液TKM溶解。?