[發明專利]小鼠肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201010110268.2
• 申請日: 2010-02-03
• 公開（公告）號: CN101914631A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 潘振華;陳林鳳;張紅;盛青松
• 申請（專利權）人: 無錫奧瑞生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 曹祖良

1.小鼠肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法，包括有標準質粒的構建、特異性引物及熒光探針的設計、實時熒光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的制備、有效性驗證及結果檢測判定，其特征在于，所述特異性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中

正向引物的序列為：5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’，

反向引物的序列為：5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；

所述熒光探針的序列為：5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’。

2.如權利要求1所述的小鼠肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法，其特征還在于，所述實時熒光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線的步驟為：

(1)模板的制備：

將構建的標準質粒作10倍系列稀釋，以稀釋液為模板；具體如下：定量標準質粒為2.94×10⁹拷貝/μl，用稀釋液將標準質粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀釋液，稀釋液在-20℃條件下保存備用；

(2)實時熒光定量PCR反應體系：

25μl的PCR反應體系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Tag?DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；

(3)循環反應：

根據步驟(2)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入熒光PCR儀中，設置相應的熒光采集條件后進行擴增，反應循環程序為：(a)、95℃預變性5min，1個循環；(b)、95℃變性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40個循環后反應結束，得到反應產物；

(4)建立檢測標準曲線：熒光PCR儀采集熒光信號，經計算機軟件自動生成以起始模板數對數為x軸，C_T值為y軸的標準曲線。

3.如權利要求1所述的小鼠肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法，其特征還在于，所述有效性驗證及結果檢測判定的步驟為：

(1)利用未感染MHV小鼠的cDNA配制陰性對照PCR反應體系：25μl的陰性對照PCR反應體系為含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Tag?DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染MHV小鼠的cDNA，1μl；

利用感染MHV小鼠的cDNA制備陽性對照PCR反應體系：25μl的陽性對照PCR反應體系為含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Tag?DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染MHV小鼠的cDNA，1μl；

(2)循環反應：

按照步驟(1)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入熒光PCR儀中，設置相應的熒光采集條件后進行擴增，反應循環程序為：(a)、95℃預變性5min，1個循環；(b)、95℃變性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40個循環后反應結束，得到反應產物；

(3)有效性驗證：

熒光PCR儀采集熒光信號，經計算機軟件生成陰性對照點和陽性對照點；陰性對照應無C_T值并且無擴增曲線，陽性對照點應位于標準曲線上，并且其C_T值應＜32，否則重做。