[發明專利]重組腫瘤特異性凋亡因子制備方法中的葉酸化修飾步驟及其制品的應用

有效

• 申請號: 201010107682.8
• 申請日: 2010-02-10
• 公開（公告）號: CN101875688A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 趙洪禮
• 申請（專利權）人: 趙洪禮
• 主分類號: C07K1/107
• 分類號: C07K1/107;C07K19/00;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 王勇

技術領域

本發明涉及一種生物制藥的制備方法及應用，尤其是具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法中的葉酸化修飾步驟、及該方法獲得的制品在抗腫瘤治療中的應用。

背景技術

癌癥治療是世界性難題，癌癥的生物治療是手術、放療、化療等方法的重要補充，尋找更有效的生物制劑已成為21世紀重點研究領域之一。目前國內外已上市的用于腫瘤治療的生物制劑主要有白細胞介素-2(IL-2)、干擾素(IFN)和單核細胞集落刺激因子(GSM)幾種，不僅可供臨床選擇的品種較少，而且均為免疫增強劑或調節劑，所以研發具有治療作用的新型生物制劑具有重要的社會意義和經濟意義。

來源于雞貧血病毒的雞貧血病毒蛋白-3(vp3)對人的各種腫瘤細胞和異常轉化細胞具有特異性殺傷作用。由于vp3能夠選擇性地誘導腫瘤細胞和轉化細胞的凋亡，而不誘導正常細胞的凋亡，被命名為腫瘤特異性凋亡因子(Apoptin)。研究結果表明，Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡不依賴于抑癌基因-53(p53)作用途徑，也不被抑制細胞凋亡基因(Bcl-2)過量表達所抑制，因此有希望成為有效治療癌癥的新型生物制劑。

與現有的抗腫瘤藥物相比Apoptin具有如下特點：

(1)Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡不依賴P53途徑，對那些P53基因突變的腫瘤細胞仍能誘導其凋亡，此點優于那些依靠P53發揮作用的抗腫瘤藥，因為后者對P53突變的腫瘤細胞無效；

(2)Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡不僅不受bcl-2過表達的抑制，反而bcl-2過表達能夠增強apoptin誘導腫瘤細胞凋亡的作用，此點優于那些被bcl-2過表達抑制的抗腫瘤藥；

(3)現有的抗腫瘤藥物盡管數量繁多，也不乏療效較好者，如紫杉醇、砷制劑等，但多數藥物毒副作用大，且反復用藥后多產生耐藥性，而使腫瘤復發，所以研制毒副作用小、療效顯著的抗腫瘤藥物是十分必要的。與紫杉醇相比，Apoptin具有獨特優勢：①不受自然資源的限制，可根據市場需求無限量的生產；②抗腫瘤作用機理獨特，效果明顯，無或低毒副作用；③Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡是通過激活胱天蛋白酶、釋放細胞色素C和激活氨基末端激酶完成的，作用機理清楚。

但是由于Apoptin為來源于雞貧血病毒的蛋白質，所以在Apoptin規模化生產和應用中存在兩個重要的技術瓶頸，一是由于種屬間的差異，人體細胞膜表面沒有其相關的蛋白受體，所以，Apoptin不能與人的細胞結合，進入細胞，引起細胞凋亡。而Apoptin誘導細胞凋亡的原理是進入細胞，激活與細胞凋亡相關的酶(主要為caspase)引起細胞凋亡。其二是原核表達的Apoptin在體外難溶解、不穩定，很難獲得大量高純度的蛋白質。所以盡管對Apoptin已經研究了十余年，但上述兩個技術難題嚴重限制了Apoptin的產業化和臨床應用，至今仍未應用于臨床。所以解決這兩個技術難題是使Apoptin實現產業化的關鍵，亦是國內外的研究熱點。

針對這兩個難題，目前國內外學者主要在以下兩個方面開展研究：①以病毒為載體，將Apoptin基因帶入腫瘤細胞，發揮Apoptin誘導腫瘤細胞發生凋亡作用。此種方法的優點是方法比較簡單、易于操作、效果肯定；其缺點是不易產業化、病毒基因作為外源基因有潛在的引起基因重組發生突變的危險、病毒作為外援抗原反復應用，會刺激機體產生抗體，減弱其作用。②采用顯微注射的方法將重組Apoptin蛋白直接注射到腫瘤細胞內。此種方法因其技術要求和設備要求很高，只適合實驗室研究，不可能規模化應用，所以不能產業化。

發明內容

為能實現產業化，本發明的目的在于提供一種重組腫瘤特異性凋亡因子制備方法中的葉酸化修飾步驟、及該方法獲得的制品在抗腫瘤治療中的應用，該步驟是，在構建谷胱肽轉移酶-腫瘤特異性凋亡因子(GST-Apoptin)融合蛋白原核表達載體(pGEX-A)的基礎上，建立起純化GST-Apoptin融合蛋白后，將葉酸連接到純化后的GST-Apoptin融合蛋白上，以激活GST-Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡的活性，使GST-Apoptin融合蛋白能夠與腫瘤細胞發生結合，用于誘導腫瘤細胞凋亡。上述三個步驟構成在大腸桿菌中高效表達、穩定好、純度高且有高活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的制備方法，及該方法獲得的制品在抗腫瘤治療中的應用，以達到能夠滿足臨床治療腫瘤的目的。

本發明提供的新型重組腫瘤特異性凋亡因子具有序列表中序列1所示的氨基酸序列；

本發明提供的新型重組腫瘤特異性凋亡因子基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列；