[發明專利]木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法

無效

• 申請號: 201010107006.0
• 申請日: 2010-02-08
• 公開（公告）號: CN101935672A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 姚永宏;柴友榮;李中林;周正科;吳全
• 申請（專利權）人: 重慶市農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及一種植物基因轉化方法，特別涉及茶樹等木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法。

背景技術

植物遺傳轉化是指通過某種技術或途徑，將外源基因導入受體植物基因組中，使其在受體植物中穩定遺傳，并賦予植物新的農藝性狀，如高抗、高產、優質、代謝物質含量的顯著變化等等。

植物遺傳轉化中，基因受體通常有體外培養材料和活體材料兩類。利用體外培養材料如原生質體、懸浮培養細胞、愈傷組織、小孢子和原初外植體等作為基因受體，即通過組織培養和植株再生來實現遺傳轉化，是目前最主要的方法。此外，使用活體材料如完整植株、種子或花粉等作為基因受體，直接將外源基因導入受體植物也取得了成功。

植物遺傳轉化技術可分為兩大類：一類是直接基因轉移技術，包括基因槍法、原生質體法、脂質體法、花粉管通道法、電激轉化法、聚乙二醇轉化法等，其中基因槍法是代表。另一類是生物介導的轉化方法，主要有農桿菌轉化法和病毒轉化法兩種，其中農桿菌轉化法操作簡便、成本低、轉化效率高，廣泛應用于雙子葉植物甚至單子葉植物的遺傳轉化。

木本植物的遺傳轉化至今為止是一大難題。眾所周知，木本植物在組織培養中經愈傷再生是非常困難的，這是限制木本植物通過組織培養和植株再生進行遺傳轉化的首要因素。此外，木本植物普遍含有大量的多酚，多酚在傷口細胞處迅速大量積累，對于植物來講是一種自我保護機制，但傷口細胞處的多酚如果過重則對農桿菌介導的基因轉化具有抑制作用，甚至對農桿菌本身具有殺傷作用，從而導致農桿菌轉化法在木本植物基于組織培養和植株再生的遺傳轉化中表現出轉化頻率很低、效果不穩定、難于重演等問題。因此，著手木本植物遺傳轉化技術的優化和創新，對推進木本植物基因工程發展意義重大，同時也是利用現代分子育種技術培育優良品種的迫切需要。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，突破了木本植物基因轉化困難和再生困難兩大技術瓶頸，不依賴于植物基因型和組織培養，具有轉化效率高，操作簡單，成本低廉等優點，適用于茶樹等大多數木本植物，尤其是頂芽飽滿的木本植物。

為達到上述目的，本發明的木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，包括以下步驟：

a、農桿菌工程菌滲透轉化液的配制：將含有目的基因的農桿菌工程菌接種于含有篩選壓的液體培養基中進行培養，當菌液OD₆₀₀值達到0.5～1.0時，向菌液中補加篩選壓，并加入滲透劑和表面活性劑，配制成農桿菌工程菌滲透轉化液；

b、活體生長錐的轉化接種：在葉層平均溫度為18～26℃、平均濕度為70～80％的條件下，將農桿菌工程菌滲透轉化液注射至木本植物新梢頂芽芽苞內的生長錐上；

c、生長錐與農桿菌工程菌的共培養：將轉化后的新梢頂芽在覆蓋吸水保濕材料并用遮陽網遮陰降溫保濕的條件下共培養2～10天，控制葉層平均溫度為18～26℃、平均濕度為70～80％；

d、抗性芽的篩選：在共培養結束后，向新梢頂芽的生長錐上補加篩選壓，抑制生長錐中非轉化細胞的分裂，使轉化細胞正常分裂并分化成抗性芽；

e、抗性枝條的培養：按常規方法進行田間施肥和病蟲防治管理，及時剪掉未經轉化處理的枝條，使抗性芽生長成抗性枝條；

f、轉基因植株的鑒定：對抗性枝條進行轉基因鑒定，結果呈陽性的植株即為轉基因植株。

進一步，所述木本植物的頂芽飽滿；

進一步，所述木本植物為茶樹；

進一步，所述步驟a是將含有目的基因的農桿菌工程菌接種于含有篩選壓、鏈霉素和利福平的LB液體培養基中進行培養，當菌液OD₆₀₀值達到0.6～0.8時，向菌液中補加篩選壓，并加入濃度為100g/L的蔗糖、體積百分濃度為0.02～0.05％的Silwet?L-77和體積百分濃度為0.01～0.05％的吐溫，配制成農桿菌工程菌滲透轉化液；

進一步，所述步驟b是在木本植物新梢頂芽飽滿的時期進行轉化接種，且轉化接種時不損傷或僅輕度損傷生長錐；

進一步，所述步驟c是先用吸水保濕性強的棉布覆蓋轉化后的新梢頂芽，再在棉布上覆蓋50％～90％遮陽網，將生長錐與農桿菌工程菌共培養6天，其中前2天用蔗糖水溶液噴濕棉布保濕，后4天用水噴濕棉布保濕。