[發(fā)明專利]Cre重組酶重組基因及Cre/loxP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因安全性植物表達(dá)載體

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010105772.3
• 申請(qǐng)日: 2010-02-04
• 公開（公告）號(hào): CN101845445A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王勇;徐亞英;陳典
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/52
• 分類號(hào): C12N15/52;C12N15/82
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 金永煥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種Cre重組酶重組基因及植物表達(dá)載體。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因植物(transgenic?plants)是指利用生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將從動(dòng)物、微生物、人類、遠(yuǎn)緣植物中提取的或人工合成的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，并使其表達(dá)而產(chǎn)生理想性狀的植物。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物無論是在品種數(shù)量上還是在種植面積上都發(fā)展得非常迅猛，其遍布范圍幾乎波及了整個(gè)地球。隨著轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入人們生活的方方面面，隨之而來的是人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的安全性的質(zhì)疑，其主要原因是由于轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的存在。標(biāo)記基因是一種用來篩選和鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和轉(zhuǎn)基因植株的DNA片段。它們主要來源于動(dòng)植物，有些甚至來自細(xì)菌、病毒和其他生物體。

標(biāo)記基因用于幫助在植物遺傳轉(zhuǎn)化中篩選和鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和再生植株。在選擇壓力下不含標(biāo)記基因及其產(chǎn)物的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞和組織死亡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有抗性，可繼續(xù)成活、分裂并分化成植株。因此，標(biāo)記基因的存在方便了植物的遺傳轉(zhuǎn)化；但獲得轉(zhuǎn)化植株后，特別是在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化過程中，標(biāo)記基因的存在是多余的，甚至是有害的，并具有一定的潛在危險(xiǎn)，例如：①轉(zhuǎn)基因植物本身可能變?yōu)殡s草或通過雜交等方式使野生近緣種變?yōu)殡s草；②標(biāo)記基因傳播到其他生物體中會(huì)引發(fā)生態(tài)失衡，如產(chǎn)生超級(jí)害蟲等；③轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)記基因及其產(chǎn)物可能對(duì)人或動(dòng)物的健康有害；④篩選劑影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖及分化；⑤相同的標(biāo)記基因向植物疊加外源標(biāo)記基因可能被轉(zhuǎn)移到人或動(dòng)物腸道寄生菌中而產(chǎn)生耐藥性，降低或喪失某種抗生素的治療作用。所以，目前本領(lǐng)域技術(shù)人員采用共轉(zhuǎn)化法、位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子法、同源重組作用等手段去除轉(zhuǎn)基因植物中的標(biāo)記基因。現(xiàn)有去除轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的方法中應(yīng)用最早、最廣泛、也最深入的是位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)中的Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，由于目前尚未在真核生物中發(fā)現(xiàn)類似的DNA重組酶，所以將原核生物的重組酶及其相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)導(dǎo)入到真核生物中可實(shí)現(xiàn)真核生物基因組中相應(yīng)的DNA片段的定位、刪除和倒位等，但由于Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)具有可逆性，導(dǎo)致其刪除效率降低。Wierz誘變分析研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)酶分子活性區(qū)域的氨基酸進(jìn)行突變，結(jié)果Cre酶活性喪失或降低。Schaikh等研究得到3個(gè)Cre重組酶的突變體，將Ala36突變?yōu)閂al、Thr41突變?yōu)镻he、Gly314突變?yōu)锳rg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個(gè)突變體均不能進(jìn)行DNA鏈的切割。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)去除轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的方法中因Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)具有可逆性，導(dǎo)致其刪除效率降低的問題，而提供的一種Cre重組酶重組基因及Cre/loxP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因安全性植物表達(dá)載體

本發(fā)明Cre重組酶重組基因命名為crein基因，crein基因的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明Cre重組酶重組基因crein基因的長度為1222bp，本發(fā)明crein基因?qū)?nèi)含子intron(AF354045.1)引入cre基因內(nèi)部，基因的頭部位置為cre基因的前3個(gè)堿基、之后為TC+內(nèi)含子intron(AF354045.1)序列、再后為cre基因的后1027個(gè)堿基。

本發(fā)明Cre/loxP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因安全性植物表達(dá)載體包含標(biāo)記基因bar、crein基因、熱激啟動(dòng)子hsp和組成型啟動(dòng)子CaMV35S，標(biāo)記基因bar和crein基因共同位于2個(gè)同向的loxP位點(diǎn)內(nèi)，其中crein基因由熱激啟動(dòng)子hsp驅(qū)動(dòng)，標(biāo)記基因bar由組成型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)。

本發(fā)明crein基因可用于Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，本發(fā)明應(yīng)用crein基因進(jìn)行植物的遺傳轉(zhuǎn)化，通過半定量RT-PCR方法檢測，Cre的表達(dá)效率提高了10％～20％，此外，由于crein基因在cre內(nèi)部引入了190bp的內(nèi)含子序列，因此避免了其在原核生物(如大腸桿菌和農(nóng)桿菌)中的滲漏表達(dá)，從而為其與loxP位點(diǎn)共同存在于一個(gè)系統(tǒng)中的操作提供了便利。

本發(fā)明Cre/loxP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因安全性植物表達(dá)載體的特點(diǎn)是在正常的生長發(fā)育溫度下熱激啟動(dòng)子hsp不具啟動(dòng)子活性，表現(xiàn)為對(duì)除草劑的抗性；而多克隆位點(diǎn)的存在允許了外源目的基因的組裝，允許選擇抗性基因和目的基因協(xié)同進(jìn)入到宿主細(xì)胞當(dāng)中。因此，當(dāng)本發(fā)明Cre/loxP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因安全性植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化完成以后，可以用熱激處理(42℃)的方法，去除選擇標(biāo)記基因。Cre作為一種重組酶，為了防止其在植物當(dāng)中再次發(fā)生整合反應(yīng)，在去除標(biāo)記基因的同時(shí)，它也一并從植物基因組中自身刪除。