[發(fā)明專利]一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法無效

申請?zhí)枺?/td>	201010105550.1	申請日：	2010-02-04
公開（公告）號：	CN101793882A	公開（公告）日：	2010-08-04
發(fā)明（設計）人：	沈錫中;薛如意;劉韜韜;董玲	申請（專利權）人：	復旦大學附屬中山醫(yī)院
主分類號：	G01N30/72	分類號：	G01N30/72
代理公司：	上海申匯專利代理有限公司 31001	代理人：	翁若瑩
地址：	200032 ***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種血清腫瘤標記 bicr6 蛋白篩選方法
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【說明書】：

技術領域

本發(fā)明涉及一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法，屬于蛋白檢測方法技術領域。

背景技術

Birc6(baculoviral?Inhibitor?of?Apoptosis(IAP)repeat-containing?6)被認為是一種抗凋亡蛋白，其基因位于染色體2p22-21。目前birc6的主要檢測方法包括蛋白免疫印記法、酶聯(lián)免疫吸附法，它們的缺點是耗時、費力，靈敏度不夠高，不適于大規(guī)模樣本的篩選。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是克服上述問題，提供一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是提供一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法，其特征在于，具體步驟為：

第一步：采取人全血，4攝氏度下凝固1小時，離心，取上層血清，保存在-80攝氏度冰箱中，將弱陽離子交換磁珠或免疫金屬親和銅離子磁珠與磁珠結合液在薄壁PCR管中混合，加入血清樣本，室溫孵育5min，將薄壁PCR管置于磁珠分離器內進行磁珠分離，移去上清，將所剩磁珠用磁珠洗滌液洗滌后，加入磁珠洗脫液，將薄壁PCR管置于磁珠分離器內進行磁珠分離，得到洗脫液，將洗脫液與磁珠穩(wěn)定液混合得到磁珠富集液；

第二步：將第一步得到的磁珠富集液加入基質溶液，按以下條件進行基質輔助激光解離電離飛行時間質譜檢測：第一離子源電壓：20kv；第二離子源電壓：18.6kv；晶體電壓：7.6kv；脈沖離子時間：320ns；極性：正；矩陣抑制模式：門控；門控強度：最大；抑制高限：600Da；檢測器：1400-1500v；樣本率：1.00Gs/s；電子獲取：增強，100mv；實時流暢：高；激光頻率：20Hz；激光衰減：關73％，范圍20％；峰檢測標準：信噪比大于5，2Da峰寬過濾，最多峰數200；

第三步：分析第二步得到的質譜圖，觀察質譜圖中質荷比為4964±1處是否有峰，若有峰，則血清中含有Bicr6蛋白。

本發(fā)明的優(yōu)點為：本發(fā)明選用快速而敏感的基質輔助激光解離電離飛行時間質譜來檢測血清birc6，屬于蛋白質組學研究范疇，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜在發(fā)現和鑒定疾病相關的蛋白或多肽方面是一個非常有效的工具，已經被用來尋找多種疾病特異性標志，該技術聯(lián)合磁性微粒富集血清蛋白的方法更加快速、有效和精確。這種以磁性微粒為基礎的高敏感性和可重復性技術讓其在蛋白組學研究領域獨樹一幟。本方法每次檢測只需要數十分鐘的時間，完成了血清birc6蛋白的富集和檢測，相對于傳統(tǒng)的蛋白免疫印記法、酶聯(lián)免疫吸附法(耗時8小時以上)操作簡單、省時，便于大批量樣本的檢測；因不依賴生物化學反應而不受反應條件的諸多限制，重復性高；另外傳統(tǒng)方法的檢測靈敏度為微克級，而本方法的檢測靈敏度達納克級，顯著高于傳統(tǒng)的方法。

附圖說明

圖1為一份經過磁珠富集后的人血清質譜檢測圖。

具體實施方式

下面結合實施例來具體說明本發(fā)明。

實施例

1.主要試劑

弱陽離子交換磁珠MB-WCX試劑盒(Bruker?Daltonik?GmbH，德國)，

免疫金屬親和銅離子磁珠MB-IMAC?Cu試劑盒(Bruker?Daltonik?GmbH，德國)

α-氰基-4-羥基肉桂酸α-Cyano-4-hydroxycinnamic?acid(HCCA)(sigma，美國)

丙酮(sigma，美國)

乙醇(sigma，美國)

AnchorChip^TM靶(Bruker?Daltonik?GmbH，德國)