[發(fā)明專利]一種菌株耐藥性的快速測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010105512.6
• 申請日: 2010-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN101760502A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁飛;陳穎;徐寶梁;趙貴明;張菲菲;楊海榮;趙勇勝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院;袁飛
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 隆天國際知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;呂俊清

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種菌株耐藥性的快速測定方法，特 別是涉及一種采用掃描獲得的菌株生長曲線而快速測定菌株對抗生素敏 感性的方法。

背景技術(shù)

目前世界衛(wèi)生組織認(rèn)為，隨著抗生素的濫用，所有主要的傳染病病原 都會(huì)逐漸對藥物產(chǎn)生抗性。耐藥菌產(chǎn)生之快、傳播之迅速、耐藥率之高已 經(jīng)引起了世界性關(guān)注。菌株的耐藥性不僅使藥物療效減弱，還會(huì)使藥物失 去療效，導(dǎo)致病人死亡率升高。菌株耐藥性的研究已成為當(dāng)今的一個(gè)世界 性熱點(diǎn)。快速、簡便地測定菌株耐藥性是控制耐藥菌的關(guān)鍵所在，可及早 發(fā)現(xiàn)耐藥菌、阻斷耐藥菌傳播、盡量縮小耐藥菌危害，具有非常重要的意 義。

目前耐藥菌的檢測方法有紙片擴(kuò)散法、肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法、自 動(dòng)化藥敏儀、Etest法和耐藥基因檢測。其中普遍采用的紙片擴(kuò)散法，通 過測量抑菌環(huán)直徑并比照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定 是否耐藥。該方法價(jià)格便宜、操作簡便，是世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法， 但是該方法花費(fèi)時(shí)間長，無法測定生長緩慢的微生物，還可能存在感染危 險(xiǎn)。肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法是將抗生素倍比稀釋在肉湯或瓊脂中，定量 測定最低抑菌濃度的方法。該方法可準(zhǔn)確定量最低抑菌濃度，但是該方法 耗時(shí)、費(fèi)力，尤其對于大批量菌的耐藥性測定，工作量太大。自動(dòng)化藥敏 儀，通過檢測濁度或熒光指示劑的熒光強(qiáng)度或底物水解反應(yīng)來判定結(jié)果。 該方法快速，適合大量檢測，但是需要昂貴的藥敏儀，無法在基層廣泛普 及。Etest法，原理是在一條塑料條背面吸附有濃度連續(xù)變化的抗生素， 其表面是相應(yīng)的抗生素濃度刻度；當(dāng)Etest條放在已接種了一定濃度細(xì)菌 的特定藥敏培養(yǎng)基上后，抗生素立即釋放至瓊脂中，呈單一方向擴(kuò)散；經(jīng) 一定時(shí)間孵育后產(chǎn)生一橢圓形的抑菌環(huán)，抑菌環(huán)與Etest條交界處的刻度 即為該菌株的最低抑菌濃度。該方法操作簡易、結(jié)果準(zhǔn)確、不需昂貴儀器， 但是Etest條價(jià)格相當(dāng)昂貴，也不適合大批量檢測。耐藥基因檢測原理是 根據(jù)耐藥基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異引物，采用PCR方法直接檢測耐藥基因，確 定被檢菌是否具有耐藥性。目前已經(jīng)有幾種菌的耐藥基因研究得比較多， 開發(fā)出了耐藥基因檢測方法，但是對于大多數(shù)菌來說，還無法采用該方法。

因此，本領(lǐng)域需要一種快速、方便并可大批量檢測菌株耐藥性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測菌株耐藥性的方法，應(yīng)用這種方 法，可快速、簡便地檢測菌種的耐藥性，確定該菌種的抗生素譜，為臨床 上確定采用何種藥物治療提供參考。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種菌株耐藥性的快速測定方法，其 包括如下步驟：

A.制備含有噻唑藍(lán)的培養(yǎng)液；

B.制備菌懸液；

C.制備抗生素溶液；

D.將上述含有噻唑藍(lán)的培養(yǎng)液、抗生素溶液、菌懸液加入到培養(yǎng)板 的孔中，系列稀釋抗生素溶液；

E.實(shí)時(shí)掃描測定，根據(jù)掃描結(jié)果測定菌株對抗生素的耐藥性。

由于只要有活菌存在，經(jīng)過培養(yǎng)就能使噻唑藍(lán)產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，因此可 根據(jù)吸收峰，確定抗生素敏感性和最低抑制濃度。例如，以測定時(shí)間為X 軸，以吸收值為Y軸，作每孔的時(shí)間-吸收曲線。如有相應(yīng)軟件，可直接 采用軟件，制作生長曲線。

在上述培養(yǎng)板上，可設(shè)置一個(gè)陰性對照，即不加菌懸液；還可再設(shè)置 一個(gè)陽性對照，即不加入抗生素。

本發(fā)明所述的菌株耐藥性的快速測定方法將噻唑藍(lán)顯色用于測定菌 株在含有抗生素的培養(yǎng)液中的生長情況。該方法與濁度法相比，具有更好 的特異性；與熒光法相比無需特殊儀器。工藝步驟E優(yōu)選使用酶標(biāo)儀掃 描以測定菌株在培養(yǎng)液中的生長情況，其與傳統(tǒng)方法相比，操作更簡便， 使用的試劑更少、更經(jīng)濟(jì)。

本發(fā)明提供的菌株耐藥性的快速測定方法是通過菌株在培養(yǎng)液中的 生長情況，判定其對抗生素的敏感性和最低抑制濃度。

本發(fā)明適宜于菌株耐藥性的快速測定，測定的菌株的耐藥性為確定該 菌種的抗生素譜、確定采用何種藥物治療提供參考。

在本發(fā)明方法中，可針對待測菌株的類別，設(shè)計(jì)抗生素。革蘭氏陰性 菌和革蘭氏陽性菌有兩套不同的抗生素設(shè)計(jì)。

使用本發(fā)明的菌株耐藥性的快速測定方法能夠簡單、快速、高效地大 量測定菌株的耐藥性，篩選出耐藥菌，確定菌株的抗生素譜。