[發(fā)明專利]蜈蚣抗腫瘤活性蛋白

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010104825.X
• 申請(qǐng)日: 2010-02-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101747423A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔毅;曹艷華;王澤根;惠晶;邵妤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/435
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/435;C07K1/20;C07K1/18;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的產(chǎn)品，具體的說(shuō)，是涉及一種蜈蚣抗腫瘤活性蛋白。

背景技術(shù)

蜈蚣為節(jié)肢動(dòng)物門(mén)唇足綱整形目蜈蚣科動(dòng)物，具有祛風(fēng)鎮(zhèn)靜、解毒散結(jié)、通絡(luò)止痛等功效，主治小兒驚風(fēng)，抽搐痙攣，中風(fēng)，半身不遂，破傷風(fēng)，風(fēng)濕頑痹，瘡瘍，瘰疬，毒蛇咬傷等，在中國(guó)的藥用歷史已有2000多年，始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》。蜈蚣種類(lèi)豐富，分布廣泛，主要種類(lèi)有少棘蜈蚣、黑頭蜈蚣、多棘蜈蚣、墨江蜈蚣等，其中少棘蜈蚣為常用品種。在近代醫(yī)學(xué)中，應(yīng)用蜈蚣治療腫瘤、結(jié)核病、百日咳、癲癇、神經(jīng)性頭痛、糖尿病等已獲得顯著療效。

經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，蜈蚣全蟲(chóng)水提物具有明顯抑瘤活性。焦波等用精原細(xì)胞，對(duì)蜈蚣水提物進(jìn)行了抗腫瘤活性的篩選，結(jié)果表明蜈蚣水提物可使小鼠睪丸第7精細(xì)管精原細(xì)胞顯著減少或消失，有一定的抗腫瘤作用(焦波，婁紅祥，王東興，等.蜈蚣提取物對(duì)小鼠精原細(xì)胞的作用.山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，37(4)：358)。曾紅等對(duì)蜈蚣NaCl-HCl提取液進(jìn)行兩次柱層析，得到八種組分，MTT法表明這八種組分均有不同程度的抗癌活性，提示蜈蚣中存在抗癌活性組分(曾紅，張國(guó)剛，程巨龍.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.湖南中醫(yī)雜志，2004，20(5)：57-58)。李風(fēng)云等研究表明蜈蚣作為中藥制劑可有效的抑制腫瘤的活性，并能提高腫瘤患者的免疫功能(李風(fēng)云，陳浩然，張蓄蘭，等.中藥制劑抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1999，27(5)：571)。但迄今為止，對(duì)蜈蚣抑瘤成分的研究多停留在粗提物的水平。而在中藥蜈蚣中，蛋白質(zhì)為主要成分，含量可達(dá)到68.8％。但目前為止，未見(jiàn)從中藥蜈蚣中分離出單一的抗腫瘤蛋白組分的相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于從傳統(tǒng)的用于抗腫瘤的動(dòng)物藥中分離出一種具有高活性、低毒副作用的蛋白，用于癌癥的治療與輔助治療。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明以少棘蜈蚣為原材料，通過(guò)水提、硫酸銨沉淀、離子交換層析、疏水層析制得，該方法具有成本低、易操作、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于蜈蚣抗腫瘤活性蛋白的大規(guī)模制備。

本發(fā)明所提供的蜈蚣抗腫瘤蛋白外觀為白色粉末，SDS-PAGE顯示是單一條帶。

發(fā)明所提供的蜈蚣抗腫瘤蛋白，經(jīng)測(cè)試具有良好的抗腫瘤活性：在給藥劑量為6.25-100μg/ml范圍內(nèi)可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

本發(fā)明所提供的蜈蚣抗腫瘤活性蛋白，主要用于各種癌癥的治療和輔助治療，如：肺癌、肝癌、乳腺癌、大腸癌等，尤其對(duì)A549，Lovo，HepG-2，MCF-7，細(xì)胞株有較強(qiáng)的殺傷作用。

本發(fā)明可以通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到：

1.蜈蚣抗腫瘤活性蛋白的制備

將蜈蚣粉碎水提后，通過(guò)硫酸銨沉淀法沉淀蛋白，然后通過(guò)離子交換色譜進(jìn)行第一步分離，分離后的組分進(jìn)行活性測(cè)定，有抗癌活性的組分再進(jìn)行疏水色譜分離，將各組分透析、濃縮、凍干后再次進(jìn)行抗癌活性測(cè)定。最終得到本發(fā)明所提供的抗腫瘤活性蛋白。

2.蜈蚣抗腫瘤蛋白的鑒定

本發(fā)明所提供的蜈蚣抗腫瘤蛋白，外觀為白色粉末，經(jīng)Lowry法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量為97.5％。對(duì)該蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，分離膠濃度為12％、濃縮膠濃度為5％，以分子量在14.4-97.4kDa的混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖1，其中，Marker：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；Sample：蜈蚣本發(fā)明中的抗腫瘤活性蛋白。由電泳圖可見(jiàn)本發(fā)明所提供的蜈蚣活性蛋白在SDS-PAGE中顯示單一條帶，分子量為20kDa。

3.蜈蚣蛋白的抗腫瘤活性

采用MTT法，取培養(yǎng)4～5天，處在指數(shù)生長(zhǎng)期的A549、Lovo、HepG-2、MCF-7癌細(xì)胞株，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋為3～4×10⁴個(gè)/ml，取96孔平板種入癌細(xì)胞稀釋液200μl，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加入用培養(yǎng)基配制并濾菌的抗腫瘤蛋白50μl，空白組和對(duì)照組加入培養(yǎng)基，空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)五個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入PBS配制的5mg/ml的MTT溶液20μl，再培養(yǎng)4～6h后，吸出上清液，每孔加DMSO200μl，震蕩，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處的吸收值，計(jì)算各濃度的蜈蚣藥液對(duì)各癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率(％)＝100％-(加藥孔A值-空白A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100％。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明SDS-PAGE圖譜

具體實(shí)施方式

1.蜈蚣抗腫瘤活性蛋白的制備：