[發明專利]基于熒光標記的肝毒性物質篩選和評價方法

有效

• 申請號: 201010104735.0
• 申請日: 2010-01-29
• 公開（公告）號: CN101788480A
• 公開（公告）日: 2010-07-28
• 發明（設計）人: 程翼宇;范驍輝;王毅;瞿海斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種基于熒光標記的肝毒性物質篩選和評價方法，具體通過以下步驟實現：

(1)硬件系統：由一臺熒光倒置顯微鏡(1)及電腦(2)構成，其中熒光倒置顯微鏡(1)包括熒光倒置顯微鏡主體(A)，高精度可控電動平臺(B)，平臺控制器(C)，電荷耦合器(D)，汞燈(E)，汞燈控制器(F)，手動操縱桿(H)，平臺控制器(C)通過接線與顯微鏡主體(A)相連，電荷耦合器(D)通過接口與顯微鏡主體(A)相連，其獲取的圖像信息由IEEE1394連接卡上傳至電腦(2)儲存，汞燈控制器(F)通過接線與顯微鏡主體(A)相連，手動操縱桿(H)通過接線與顯微鏡主體(A)相連；軟件系統：高精度可控電動平臺控制與圖像采集控制系統，圖像拼接系統，圖像識別系統；

(2)二乙酸熒光素染色特異性標記活細胞

準確稱取適量二乙酸熒光素溶于二甲基亞砜中配成10mg/mL儲備液，分裝于0.6mL離心管中，置于-20℃避光儲存，臨用前，用磷酸鹽緩沖液稀釋儲備液4000倍待用，

(a)二乙酸熒光素最佳染色濃度選擇

在96孔板中接種人肝癌細胞HepG2和人正常肝細胞L-O2，3000個/孔，只種96孔板中間60孔，置于細胞培養箱中過夜使細胞貼壁完全，第二天，棄去每孔中培養液，加入100μL/孔含系列濃度梯度的二乙酸熒光素的磷酸鹽緩沖液，二乙酸熒光素濃度梯度在0.078～40μg/mL之間，每個濃度6復孔，置于室溫孵育15分鐘，接著用100μL/孔磷酸鹽緩沖液漂洗，吸干，在高精度可控電動平臺(B)上讀取熒光圖像，熒光拍攝參數為：綠色熒光濾光片，激發光460-500nm、發射光512-542nm，曝光時間500ms，物鏡放大倍數2.5倍，每孔拍攝6幅圖像，并經過熒光圖像拼接、圖像識別以及數據輸出系統將結果進行統計，選擇最佳二乙酸熒光素染色濃度，作為后續所有實驗的熒光染色濃度；

(b)二乙酸熒光素熒光染色測量活細胞數法線性動態范圍及細胞種板細胞數量選擇

HepG2細胞和L-O2細胞按照倍半稀釋的方式，細胞種于96孔板內60孔中，每個細胞數量5個孔平行，從50000個/孔一直倍半稀釋12個數量梯度，即25～50000個細胞每孔，孵育及細胞染色條件同步驟(a)，同時，每個細胞株各做兩塊板，分別用于二乙酸熒光素熒光染色和噻唑藍法測量，掃描得到的熒光圖像經過熒光圖像拼接、圖像識別以及數據輸出系統將結果進行統計，通過繪制二乙酸熒光素法熒光強度～細胞數量對數值、噻唑藍法吸光度值～細胞數量對數值曲線，比較兩種細胞活力測定方法線性動態范圍、靈敏性以及兩個細胞株的選擇性；

(3)對化合物或中藥材中肝毒性成分開展篩選并評價其毒性

(a)采用體外肝毒性細胞模型HepG2和L-O2，細胞的種板數量為3000個/孔，細胞培養過夜讓其貼壁充分；次日進行加藥操作，以對乙酰氨基酚和鹽酸氯丙嗪為肝毒性陽性化合物，其中對乙酰氨基酚設定9個濃度梯度為13.65～0.053mmol/L，鹽酸氯丙嗪設定9個濃度梯度為163.5～0.639μmol/L，同時設定正常細胞對照組；

(b)取化合物和中藥材的不同成分與細胞HepG2、L-O2共孵育48小時，之后棄去每孔中培養液，每孔加入含2.5μg/mL二乙酸熒光素磷酸鹽緩沖溶液，室溫避光孵育15分鐘，在高精度可控電動平臺(B)上讀取熒光圖像，熒光拍攝參數為：綠色熒光濾光片，激發光460-500nm、發射光512-542nm，曝光時間500ms，物鏡放大倍數2.5倍，每孔拍攝6幅圖像，并經過熒光圖像拼接、圖像識別以及數據輸出系統將結果進行統計，結果以細胞成活率表示：

成活率％＝加藥處理組熒光強度/正常對照組熒光強度×100

對乙酰氨基酚和鹽酸氯丙嗪以細胞成活率對濃度梯度做量效曲線，計算IC₅₀值，用IC₅₀值來評價毒性的強弱；

在篩選中設定正常細胞組、陽性損傷對照組及溶劑對照組，陽性損傷對照組為：13.65mmol/L的對乙酰氨基酚和163.54μmol/L的鹽酸氯丙嗪，溶劑對照組為：0.1％v/v二甲基亞砜。

2.根據權利要求1所述的一種基于熒光標記的肝毒性物質篩選和評價方法，其特征在于，步驟(3)中，對于中藥材，在與細胞HepG2、L-O2共孵育48小時前，需經過加熱回流提取、中壓柱分離及制備液相分離的前處理，將中藥材分成不同的成分，每個成分用二甲基亞砜溶解成50mg/mL的儲備液，中藥材成分用于肝毒性成分篩選時使用濃度為50μg/mL。