[發明專利]一種甘蔗黃葉病毒兩種基因型的鑒別方法

無效

• 申請號: 201010103822.4
• 申請日: 2010-02-02
• 公開（公告）號: CN101736093A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 王明強;李文鳳;黃應昆;王曉燕;羅志明
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司 53100
• 代理人: 陳左

1.一種甘蔗黃葉病毒兩種基因型的鑒別方法，其特征在于步驟如下：

1)RT-PCR引物設計：

根據GenBank數據庫中已報道的代表甘蔗黃葉病毒BRA基因型的分離物SCYLV-A(登錄號AF157029)序列和周國輝等在我國蔗區發現的代表CHN1基因型的SCYLV-chn1序列，經序列比對，根據兩種基因型代表分離物的序列差異，設計只可擴增BRA基因型分離物的特異引物對B1/B2，預期擴增片段766bp；設計只可擴增CHN1基因型分離物的特異引物對C1/C2，預期擴增片段448bp，引物序列如下：

BRA基因型特異引物對：

B1：5’GAAACCGATTTTGATAATCTGTC??3’，

B2：5’CGGAGACTCATACACAAAATTA???3’，

CHN1基因型特異引物對：

C1：5’GCTTCTCCCGGAGGTTCACT??3’，

C2：5’TCGAGAACAACCTCCGCCTT??3’，

2)甘蔗葉組織總RNA的抽提：

采用H.Q.&.Q.溶液型RNA抽提試劑盒抽提新鮮葉片組織總RNA，具體步驟為：

(1)稱取60mg新鮮甘蔗葉片放入已滅菌的研缽中，加入液氮研磨成粉末狀后，迅速加入1mL?Reagent，充分研磨混勻后，轉至1.5mL滅菌的離心管中；

(2)向裝有研磨混合液的離心管中加入200μL的氯仿，劇烈振蕩15s，冰浴中放置10min；

(3)室溫下，12000rpm，離心15min；

(4)取上清液(約400μL)轉移至新的1.5mL滅菌的離心管中，加入500μL異丙醇后，漩渦混勻，室溫靜置10min；

(5)室溫下，12000rpm，離心10min；

(6)棄上清，加入80％乙醇1mL，室溫下，7500rpm，離心5min；

(7)棄上清，加入無水乙醇1mL，室溫下，7500rpm，離心5min；

(8)殘液用移液器吸出后，室溫下，風干15min；

(9)加入100μL?DEPC處理的滅菌ddH₂O，輕彈使充分溶解，稍離心后，置于-20℃的冰箱中備用，作為RT-PCR擴增的模板；

3)RT-PCR擴增：

以抽提的甘蔗葉組織的總RNA為模板，分別用兩對引物對RT-PCR進行一步法RT-PCR擴增，擴增抽提的甘蔗樣品RNA，RT-PCR采用TaKaRa?PrimeScript?OneStep?RT-PCR?Kit?Ver.2試劑盒進行，具體步驟為：

引物對B1/B2的反應體系：

RNase?Free?dH₂O???????????????20.0μL

2×1?Step?Buffer??????????????25.0μL

PrimeScript?1Step?Enzyme?Mix??2.0μL

B1(5μM)??????????????????????1.0μL

B2(5μM)??????????????????????1.0μL

RNA模板???????????????????????1.0μL

總體積????????????????????????50.0μL

引物對C1/C2的反應體系：

RNase?Free?dH₂O???????????????20.0μL

2×1?Step?Buffer??????????????25.0μL

PrimeScript?1?Step?Enzyme?Mix?2.0μL

C1(5μM)??????????????????????1.0μL

C2(5μM)??????????????????????1.0μL

RNA模板???????????????????????1.0μL

總體積????????????????????????50.0μL

所述反應體系在冰浴中配制，反應程序：

4)電泳觀察結果：

取5μL?RT-PCR產物經1.2％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和90V的電壓下電泳40min后，用BIO-RAD凝膠成像系統觀察：引物對B1/B2擴增BRA基因型分離物可得到預期大小的目的條帶，而CHN1基因型分離物、健康的甘蔗植株及清水對照中未擴增到任何條帶；引物對C1/C2擴增CHN1基因型分離物可得到預期大小的目的條帶，而BRA基因型分離物、健康的甘蔗植株及清水對照中未擴增到任何條帶。