[發(fā)明專(zhuān)利]一種高靈敏全血他克莫司定量檢測(cè)試劑盒及其制備

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010102471.5
• 申請(qǐng)日: 2010-01-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102141552A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜合作;劉麗宏;李鵬飛;馬萍;吳誠(chéng);童衛(wèi)杭
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/06
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/06;G01N1/28;G01N30/50;G01N30/89
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于液相色譜質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)發(fā)的全血中他克莫司定量檢測(cè)試劑盒，更具體地說(shuō)是采用液相色譜質(zhì)譜技術(shù)對(duì)全血中他克莫司進(jìn)行高靈敏度定量檢測(cè)的方法。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明試劑盒的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

他克莫司(tacrolimus，簡(jiǎn)稱(chēng)FK506)是從鏈霉菌屬培養(yǎng)物中分離得到的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)新型免疫抑制劑，能有效抑制T淋巴細(xì)胞激活。FK506與內(nèi)源性細(xì)胞受體結(jié)合，形成一個(gè)親免素復(fù)合物，從而發(fā)揮藥理作用。目前FK506已在肝、腎、心、胰等器官移植中廣泛用于抗排斥及自身免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療。FK506的血藥濃度與免疫抑制強(qiáng)度和毒副反應(yīng)相關(guān)，不僅治療窗窄而且藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大，臨床使用FK506需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。

目前臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)FK506全血濃度的方法主要有微粒子捕捉酶免疫發(fā)光技術(shù)(microparticle?enzyme?immunoassay，MEIA)和酶聯(lián)吸附免疫分析技術(shù)(enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)。ELISA法和MEIA法對(duì)體內(nèi)FK506及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，使實(shí)際測(cè)得結(jié)果為FK506及其代謝物之和。

液相色譜質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)是近年來(lái)迅速發(fā)展的定量分析技術(shù)，具有高選擇性、高靈敏度、樣本處理簡(jiǎn)單和自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，日漸成為體內(nèi)藥物分析、新生兒遺傳疾病篩查和藥物代謝研究等領(lǐng)域的實(shí)用方法。研究開(kāi)發(fā)一種結(jié)果準(zhǔn)確、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、易于推廣的FK506血藥濃度的LC-MS/MS檢測(cè)試劑盒，使其能廣泛應(yīng)用于我國(guó)FK506臨床研究和常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)中，將有助于提高FK506檢測(cè)質(zhì)量、促進(jìn)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高靈敏全血他克莫司定量檢測(cè)試劑盒，以滿足他克莫司臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)和大規(guī)模臨床研究的需要。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒的制備方法。

技術(shù)方案

本試劑盒是一種采用LC-MS/MS測(cè)定人全血樣本中FK506濃度的新型試劑盒。試劑盒以子囊霉素為內(nèi)標(biāo)，先用硫酸鋅溶液處理全血樣本，然后用乙腈沉淀，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)，記錄FK506和內(nèi)標(biāo)的峰面積。采用內(nèi)標(biāo)法，根據(jù)待測(cè)樣本中的FK506/內(nèi)標(biāo)峰面積比值即可計(jì)算出FK506濃度。測(cè)定結(jié)果為全血樣本中FK506濃度。

本發(fā)明的試劑盒制備過(guò)程包括如下步驟：

1.他克莫司儲(chǔ)備液、他克莫司母液、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本、質(zhì)控樣本的配制：精密稱(chēng)取5mg他克莫司對(duì)照品，置10mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀釋至刻度，配制成0.5mg/mL的他克莫司儲(chǔ)備液。精密量取他克莫司儲(chǔ)備液0.5mL，置50mL容量瓶中，加全血稀釋至刻度，配制成5μg/mL的他克莫司母液。分別精密量取他克莫司母液0、0.01、0.03、0.1、0.3、0.5mL，分別置50mL容量瓶中，加全血稀釋至刻度，所配制他克莫司標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本濃度分別為0、1、3、10、30、50ng/mL，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。分別精密量取他克莫司母液0.025、0.1、0.4mL，置50mL容量瓶中，加全血稀釋至刻度，所配制他克莫司質(zhì)控樣本濃度分別為2.5、10、40ng/mL，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。

2.樣本處理液的配制：精密稱(chēng)取14.38g?ZnSO₄·7H₂O，置500mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即為100mmol/L硫酸鋅溶液，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。

3.內(nèi)標(biāo)液的配制：精密稱(chēng)取1mg子囊霉素對(duì)照品，置50mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀釋至刻度，配制成20μg/mL的儲(chǔ)備液，?精密量取上述子囊霉素儲(chǔ)備液1mL，置1000mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀釋至刻度，即為20ng/mL子囊霉素溶液，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。

4.流動(dòng)相調(diào)節(jié)液的配制：精密稱(chēng)取38.5g乙酸銨，置500mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即為1mol/L乙酸銨溶液，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。

本發(fā)明的試劑盒使用方法如下：

精密取全血樣本100μL置1.5mL?EP管中，加入樣本處理液100μL，再加入內(nèi)標(biāo)液300μL，渦流混勻2min，靜置30min，離心5min(12000rpm)，取上清液進(jìn)樣20μL進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。

有益效果