[發(fā)明專利]利用新鮮羊膜制備組織工程人工角膜內(nèi)皮載體支架的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010102340.7
• 申請(qǐng)日: 2010-01-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101843923A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊廷俊;趙君;馬西亞;叢日山;楊洪收;于昊澤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/36
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/36;A61L27/24;A61L27/22
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用新鮮羊膜制備組織工程人工角膜內(nèi)皮載體支架的方法，屬于組織工程人工角膜內(nèi)皮技術(shù)。

背景技術(shù)

人角膜內(nèi)皮在維持角膜厚度、透明度及為角膜提供養(yǎng)分等方面具有至關(guān)重要的作用。當(dāng)角膜受到感染或手術(shù)創(chuàng)傷后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞便發(fā)生不同程度的減少，一旦角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度低于形成完整角膜內(nèi)皮層和維持角膜內(nèi)皮生理功能的臨界密度后，角膜內(nèi)皮將出現(xiàn)不可逆病變，即角膜內(nèi)皮盲。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)目前約有角膜內(nèi)皮盲患者80余萬(wàn)人，絕大多數(shù)患者可以通過(guò)角膜移植來(lái)治愈，但由于捐獻(xiàn)角膜的高度匱乏致使絕大部分患者得不到角膜移植而無(wú)法復(fù)明。近年來(lái)，角膜組織工程的興起為組織工程人工角膜內(nèi)皮的體外重建及其臨床應(yīng)用創(chuàng)造了條件，也為角膜內(nèi)皮盲患者通過(guò)組織工程人工角膜內(nèi)皮的移植和重見(jiàn)光明帶來(lái)了新的希望。

對(duì)組織工程人工角膜內(nèi)皮的體外重建研究開(kāi)始于1990年初，如何獲得足量的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞和理想的載體支架是目前組織工程人工角膜內(nèi)皮體外重建研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者們分別利用癌基因轉(zhuǎn)染的永生化人角膜內(nèi)皮細(xì)胞、原代培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞或體外培養(yǎng)至第4-5代的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，分別利用角膜后彈力層、去上皮層羊膜、膠原-殼聚糖共混膜、聚羥乙基丙烯酸甲酯、無(wú)細(xì)胞豬角膜基質(zhì)和N-(1-甲基乙基)-2-丙烯酰胺均聚物等作為載體支架，在體外成功重建出形態(tài)、透明度和組織結(jié)構(gòu)與正常角膜內(nèi)皮近似的人角膜內(nèi)皮組織類(lèi)似物，為組織工程人工角膜內(nèi)皮的體外重建開(kāi)辟了道路，但由于所用種子細(xì)胞或者是轉(zhuǎn)染了癌基因的永生化細(xì)胞或者是來(lái)自眼庫(kù)角膜的原代培養(yǎng)細(xì)胞或者是在24孔培養(yǎng)板中僅傳4-5代的細(xì)胞，由于種子細(xì)胞具有潛在致瘤性或數(shù)量極其有限，因而限制了組織工程人工角膜內(nèi)皮的規(guī)模化體外重建及其臨床應(yīng)用。現(xiàn)有組織工程人工角膜內(nèi)皮體外重建的研究報(bào)道，仍局限于實(shí)驗(yàn)研究，根本無(wú)法滿足我國(guó)80余萬(wàn)、全世界1000余萬(wàn)角膜內(nèi)皮盲患者臨床移植的大量需要。

2005年，樊廷俊等首次成功建立了國(guó)際上唯一1個(gè)沒(méi)有任何致瘤性的非轉(zhuǎn)染人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系，成功解決了組織工程人工角膜內(nèi)皮規(guī)模化重建無(wú)法獲得大量種子細(xì)胞的問(wèn)題。因此，盡早建立理想載體支架的規(guī)模化制備技術(shù)，進(jìn)而為組織工程人工角膜內(nèi)皮規(guī)模化重建創(chuàng)造條件，已成為各國(guó)學(xué)者們開(kāi)展角膜組織工程研究的主攻目標(biāo)，也是全世界角膜內(nèi)皮盲患者重見(jiàn)光明的希望之所在。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是利用新鮮羊膜制備組織工程人工角膜內(nèi)皮的載體支架，提供一種組織工程人工角膜內(nèi)皮載體支架的制備方法。

本發(fā)明的方法：首先用眼科鑷撕除低溫保存的新鮮羊膜的纖維細(xì)胞層和海綿層，用0.9％生理鹽水沖洗干凈后，放入1∶1000硫酸妥布霉素液(500萬(wàn)單位，用0.9％生理鹽水配制)中，放置在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)浸泡消毒20～30分鐘，用無(wú)菌D-Hanks溶液漂洗3～5分鐘。

將已滅菌濾紙平鋪于無(wú)菌玻璃板上，滴加0.1％～0.3％胰蛋白酶和0.01％～0.02％EDTA消化液(1∶1)使濾紙充分濕潤(rùn)，將漂洗后的羊膜按上皮面朝下的方向平鋪于濾紙上，放置至37℃培養(yǎng)箱中消化30～60分鐘，即倒置消化法。

然后，用細(xì)胞刮刀輕刮羊膜的上皮面，以全部去除殘留的上皮細(xì)胞，用無(wú)菌D-Hanks溶液沖洗3～5次，獲得去上皮層羊膜，用打孔器將羊膜打成直徑15.6毫米的圓片，按上皮面朝上平鋪于24孔培養(yǎng)板孔中，放入5％CO₂培養(yǎng)箱中、37℃進(jìn)行干貼15～25小時(shí)。

最后，在無(wú)菌條件下向干貼有羊膜的24孔培養(yǎng)板孔中，按1毫升/孔的量輕輕加入去上皮層羊膜專用包被液，將培養(yǎng)板置37℃培養(yǎng)箱中包被處理15～25小時(shí)，無(wú)菌吸出包被液并晾干，即可作為組織工程人工角膜內(nèi)皮的載體支架使用。

本發(fā)明所用去上皮層羊膜專用包被液的配方為：D-Hanks溶液，0.075‰～0.125‰IV型膠原；

為了提高人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在去上皮層羊膜載體支架上的貼附效果，本發(fā)明又添加了0.075‰～0.125‰纖連蛋白；

為了進(jìn)一步提高人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在去上皮層羊膜載體支架上的貼附效果，本發(fā)明又添加了0.0075‰～0.0125‰層粘連蛋白。