[發明專利]實時靈敏生物大分子檢測新方法及試劑盒制備

無效

• 申請號: 201010102258.4
• 申請日: 2010-01-27
• 公開（公告）號: CN102135543A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 樂加昌;陶寧;張旭;李學仁
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 吳小明

技術領域

本發明屬于納米生物新技術領域，涉及旋轉式ATP馬達構建的納米生物傳感器的設計、組裝及在病毒、蛋白快速靈敏檢測中的新方法與其對應的檢測試劑盒制備與應用。

背景技術

本發明人于2004年12月16日提交了題為“可調控分子馬達微動力生物傳感器”的中國專利申請(公開日：2006年6月21日，CN1789425，已授權)，公開了一種可調控分子馬達微動力生物傳感器，其包含以下部分：(1)旋轉馬達：F₀F₁-ATP酶；(2)光能轉換裝置：光反應中心與復合物(RC)和泛醌；(3)電子轉換裝置：與光能轉換裝置為同一體系；(4)信號分子輸出裝置：由光激發與發射裝置和熒光探針組成；(5)能源系統：由水，ATP，ADP，無機磷，和可見光組成；(6)保護層：雙層脂膜作位內膜的保護層；(7)支架材料和雙層脂膜的固定材料。該專利公開了熒光探針可以是位于膜外側的Lipids-熒光素，位于膜內側的熒光素，分子馬達旋轉是由ATP水解驅動的，其中所述分子馬達旋轉是由能轉換的跨膜電化學電位差驅動的，或者所述跨膜電化學電位差是由光能或化學能轉換的。在該生物傳感器中，負載是連接在生物傳感器的分子馬達的三個β亞基上。該專利還公開了所述可調控分子馬達微動力生物傳感器在生物大分子、病毒分子等的檢測中的應用。

發明內容

本發明是對該中國專利申請號200410098929.9的進一步重要改進，主要的區別：(1)在于本發明用旋轉式分子馬達原理的生物傳感器，發明了具有一種全新的功能分子器件，該器件具備對生物分子進行邊捕捉目標分子，邊旋轉將其捕捉到目標分子實時過程的功能為一體，發展成為實時靈敏快速檢測新技術；(2)對前一專利(中國專利申請號200410098929.9)中熒光測定的原理和方法進行了重要的改進，提出了將ATP合酶的合成過程中的產物ATP作為熒光淬滅劑，結合ATP合酶的合成過程中質子外流引起的膜外pH改變引起的熒光強度減弱，兩者對熒光的減弱效應在我們的反應條件下具有協同作用；(3)在分子馬達旋轉驅動的能源方面，本發明將光能轉換技術改進為化學能驅動，此改進將生物傳感器邊捕捉目標分子，邊測定熒光強度的設想變成可能；(4)本發明與檢測試劑盒制備新方法結合在一起，使基于旋轉式分子馬達原理的生物傳感器的實際應用成為可能；上述檢測方法及試劑盒制備技術可廣泛擴展應用于環境、國防、能源、信息等眾多領域，有極其廣泛的應用價值和巨大的經濟與社會效益。

本發明從分子馬達生物傳感器的角度，構建以F₀F₁-ATPase蛋白質旋轉分子馬達為基礎的，以生物素-親和素-生物素為連接成分，以病毒蛋白抗體為捕獲體的高靈敏、快速檢測體系，產生類似于微動力旋轉捕獲器的效應，明顯縮短了反應時間，采用ATP、質子外流雙淬滅熒光技術，有效提高了信噪比，采用sol-gel技術(溶膠-凝膠法)提高了生物馬達生物芯片的均一性，實現了實時靈敏快速檢測。

具體地，本發明提供以下各項：

1.一種納米生物傳感器，其包括載色體，該載色體上含有分子馬達F₀F₁-ATPase，其中所述F₀F₁-ATPase的ε亞基上連接有生物大分子。

2.根據以上1所述的納米生物傳感器，其中所述載色體(chromatophores)是來自(制備自)編號為ATCC?27502的嗜熱菌(Thermomicrobium?roseum)。

3.根據以上1所述的納米生物傳感器，其中所述ε亞基是經由抗ε亞基抗體與所述生物大分子連接。

4.根據以上4所述的納米生物傳感器，其中所述抗ε亞基抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。

5.根據以上1所述的納米生物傳感器，其中所述抗ε亞基抗體是通過生物素-親和素-生物素與所述生物大分子連接。

6.根據以上1-5中任一項所述的納米生物傳感器，其中所述生物大分子是DNA、小RNA(小干擾RNA，反義RNA等)、或蛋白質(親和性受體/配體，抗原/抗體)，優選病毒分子特異性抗原(例如病毒蛋白)的抗體，該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。

7.根據以上1-6任一項所述的納米生物傳感器在制備用于檢測生物大分子的試劑中的應用。

8.根據以上7所述的應用，其中所述納米生物傳感器經過了sol-gel技術(溶液-凝膠法)處理。

9.根據以上7或8所述的應用，其中所述試劑用于96孔芯片型快速靈敏檢測。

10.試劑盒，其包含：