[發(fā)明專利]一種微乳液克隆擴(kuò)增結(jié)合水凝膠微球芯片數(shù)字化檢測(cè)微突變的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010102163.2
• 申請(qǐng)日: 2010-01-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101736087A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周國(guó)華;黃歡;乞宗泰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 夏平;劉成群

1.一種檢測(cè)微突變的方法，其特征在于該方法是采用微球介導(dǎo)的微乳液克隆擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合水凝膠芯片固定微球熒光檢測(cè)及數(shù)字化分析技術(shù)進(jìn)行微突變檢測(cè)的方法。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)微突變的方法，其特征在于微球介導(dǎo)的微乳液克隆擴(kuò)增技術(shù)是將片段化的DNA模板、表面固定有擴(kuò)增引物的微球以及PCR反應(yīng)體系的混合物分散并包裹在油包水的微乳液微囊中同時(shí)并列進(jìn)行微乳液PCR擴(kuò)增，微乳液PCR擴(kuò)增后，破乳，收集微球，將微球上擴(kuò)增出的雙鏈目的片段制備成單鏈DNA擴(kuò)增片段；

其中：

每個(gè)微囊最多僅包含一個(gè)片段化的DNA模板分子、一個(gè)微球和PCR反應(yīng)體系的混合物；

每個(gè)微球表面只固定一種擴(kuò)增引物，固定的擴(kuò)增引物是與片段化的DNA模板對(duì)應(yīng)的一種基因特異性引物或者是與片段化的DNA模板對(duì)應(yīng)的用于PCR擴(kuò)增的一種公用引物；

PCR反應(yīng)體系中的擴(kuò)增引物含有與微球表面固定的擴(kuò)增引物成對(duì)的引物；

片段化的DNA模板是指將DNA模板打斷成小片段直接使用或者連接加尾。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)微突變的方法，其特征在于連接加尾的片段化的DNA模板是以樣本DNA分子為模板，進(jìn)行多重連接依賴式探針擴(kuò)增連接，連接后的產(chǎn)物即為片段化的DNA模板；每個(gè)突變位點(diǎn)使用三條MLPA的探針，分別為一條左探針和兩條右探針；左探針包含兩部分：一是與微球結(jié)合的公用引物相同的序列，二是一段與模板突變位點(diǎn)左側(cè)適當(dāng)長(zhǎng)度的基因互補(bǔ)的特異性序列；兩條右探針均包含三部分：一端是與微球結(jié)合的公用引物成對(duì)的引物互補(bǔ)的序列，中間是與不同熒光探針雜交的特異性序列，另一端是一段與模板突變位點(diǎn)及突變位點(diǎn)右側(cè)適當(dāng)長(zhǎng)度的基因互補(bǔ)的特異性序列；兩條右探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)了微突變的一個(gè)等位特異性位點(diǎn)以及分別對(duì)應(yīng)包含了一段特異性序列用于與一種熒光探針互補(bǔ)雜交。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)微突變的方法，其特征在于表面固定有擴(kuò)增引物的微球是將3’端NH₂修飾的一種擴(kuò)增引物固定在NHS-瓊脂糖微球表面而得到。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)微突變的方法，其特征在于每個(gè)微囊最多僅包含一個(gè)片段化的DNA模板分子、一個(gè)微球和PCR反應(yīng)體系的混合物是通過(guò)下列方法實(shí)現(xiàn)的：

將225μl?Mock溶液與375μl油相于5ml的容器中混合并用磁力攪拌子在磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min，可見(jiàn)溶液呈微乳狀，再加入200μl?PCR混合物，繼續(xù)在磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min形成均勻的油包水的微乳液；

其中，Mock溶液的組成為1×PCR緩沖液，2mM?MgCl₂，0.1％BSA；油相的組成按為40％(w/w)DC?5225C配方助劑，30％(w/w)DC?749流體和30％(w/w)Ar20硅油；PCR混合物包含片段化的DNA模板，1×PCR緩沖液，2mM?MgCl₂，0.5mM?dNTP混合物，0.1U/μl?Taq?DNA聚合酶，0.06μM的正向引物，0.6μM的反向引物，0.1％BSA，0.01％Tween-80以及表面固定有正向引物的微球，微球的數(shù)量與DNA模板拷貝數(shù)的比例在10∶1到1∶1之間，DNA模板的最大量為10⁷數(shù)量級(jí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)微突變的方法，其特征在于油包水的微乳液在PCR過(guò)程中需保持微乳液的狀態(tài)不變，不會(huì)因?yàn)闇囟鹊淖兓鹌迫椋凰玫降挠拖酁?0％(w/w)DC?5225C配方助劑，30％(w/w)DC?749流體和30％(w/w)Ar20硅油，所用到的油水相體積比在3∶5到5∶5之間。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)微突變的方法，其特征在于破乳的方法是指將擴(kuò)增后的微乳液與異丙醇混合后，注入裝有微孔濾膜的濾器，在濾膜上截留微球，將微乳液過(guò)濾除去；將微球上擴(kuò)增出的雙鏈目的片段制備成單鏈DNA擴(kuò)增片段是將微球上擴(kuò)增出的雙鏈產(chǎn)物堿變性解鏈后吸去含游離的另一條單鏈DNA的堿液，收集固定有單鏈DNA擴(kuò)增片段的微球。