[發明專利]一種檢測感染馬鈴薯的病毒的方法及其專用引物

有效

• 申請號: 201010102020.1
• 申請日: 2010-01-27
• 公開（公告）號: CN101851685A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 李明福;黃新;劉梅
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種檢測感染馬鈴薯的病毒的方法及其專用引物。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。PCR反應類似于DNA的天然復制過程，由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成，即在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。通過PCR，能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點，PCR已廣泛應用于生物檢測和疾病診斷等領域。

多重PCR是在普通PCR的基礎上加以改進，原理與常規PCR基本相同，只是在一個PCR反應體系中加入兩對以上引物，針對多個模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術。

在上述兩種PCR反應中，引物設計的好壞直接影響檢測的特異性和靈敏度。然而，傳統的PCR體系中，引物二聚體的形成以及引物與模板的錯配嚴重制約PCR技術的應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測感染馬鈴薯的病毒的方法及其專用引物。

本發明提供了輔助檢測感染馬鈴薯的病毒的專用引物，包括如下五對引物中的至少一對：

引物對I：序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對；

引物對II：序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列組成的引物對；

引物對III：序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列組成的引物對；

引物對IV：序列表的序列7和序列表的序列8所示核苷酸序列組成的引物對；

引物對V：序列表的序列9和序列表的序列10所示核苷酸序列組成的引物對；

所述感染馬鈴薯的病毒為煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯V病毒或煙草環斑病毒。

所述專用引物具體由所述引物對I、所述引物對II、所述引物對III、所述引物對IV和所述引物對V組成。

所述專用引物可應用于輔助檢測感染馬鈴薯的病毒；所述感染馬鈴薯的病毒為煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯V病毒或煙草環斑病毒。

所述專用引物可應用于制備輔助檢測感染馬鈴薯的病毒的試劑盒；所述感染馬鈴薯的病毒為煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯V病毒或煙草環斑病毒。

本發明還保護一種輔助檢測感染馬鈴薯的病毒的試劑盒，它包括所述專用引物；所述感染馬鈴薯的病毒為煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯V病毒或煙草環斑病毒。

所述試劑盒可應用于輔助檢測感染馬鈴薯的病毒；所述感染馬鈴薯的病毒為煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯V病毒或煙草環斑病毒。

本發明提供了輔助檢測待測生物樣本中含有哪種或哪幾種感染馬鈴薯的病毒的方法，所述感染馬鈴薯的病毒為煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯V病毒或煙草環斑病毒，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

以待測樣本的cDNA為模板，任一所述專用引物進行PCR，檢測PCR產物；如果得到152bp的PCR產物，則待測樣本中含有煙草花葉病毒；如果得到879bp的PCR產物，則待測樣本中含有馬鈴薯X病毒；如果得到563bp的PCR產物，則待測樣本中含有馬鈴薯Y病毒；如果得到615bp的PCR產物，則待測樣本中含有馬鈴薯V病毒；如果得到343bp的PCR產物，則待測樣本中含有煙草環斑病毒。

所述方法中，所述PCR的反應參數為：94℃、15min；94℃、30sec，60℃、30sec，72℃、70sec，34個循環；72℃、10min。

檢測煙草花葉病毒(CMV)的引物序列為：

CMV-f：5’-GCGCATTCAAATTCGAGTTAATIIIIIGCCGAAAT-3’(序列1)；

CMV-r：5’-GCATACTGATAAACCAGTACCGGTIIIIITCCGTCCG-3’(序列2)。

目的條帶為152bp。

檢測馬鈴薯X病毒(PVX)的引物序列為：

PVX-f：5’-ATCCCTTTGGACCTGCTTAGIIIIIGAGACTACGG-3’(序列3)；

PVX-r：5’-TTTCCCAGAAGGCCGAAGIIIIIGCACTTGTGTTC-3’(序列4)。

目的條帶為879bp。