[發(fā)明專利]回收Cohn氏組分Ⅳ沉淀中白蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010101816.5
• 申請日: 2010-01-19
• 公開（公告）號: CN101792490A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃錦程;汪偉軍;王文杰;黃邦春;黃育升;黃進義;陳成坤;黃國華
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/14
• 代理公司: 汕頭市高科專利事務(wù)所 44103
• 代理人: 王少明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及血制品的分離方法，具體是采用低溫乙醇法從Cohn氏組分 IV沉淀中分離回收白蛋白的方法。

背景技術(shù)

低溫乙醇工藝分離血漿蛋白，自20世紀(jì)40年代創(chuàng)建以來，至今已有60 年的歷史。Cohn教授及其領(lǐng)導(dǎo)的開發(fā)團隊所創(chuàng)立的Cohn?6法已成為白蛋 白分離的經(jīng)典方法，是國際上通用的血漿白蛋白分離工藝的基礎(chǔ)。隨后所 使用的各種白蛋白分離方法依舊以Cohn?6法中的pH值、溫度、乙醇濃度、 離子強度和蛋白濃度5項參數(shù)為依據(jù)，通過不同的參數(shù)組合，可進行其它 多種蛋白制品的分離。

Cohn氏組分IV沉淀中殘留有少量白蛋白。從人血組分IV沉淀中分離白 蛋白的方法基本使用低溫乙醇法和熱乙醇法。低溫乙醇法是在低溫下，以 乙醇作為溶劑，利用白蛋白與其它雜蛋白結(jié)晶條件的不同而將白蛋白與其 它雜蛋白分離?！吨袊帢I(yè)》2003年第12卷第04期《從Cohn氏組分IV 沉淀中回收白蛋白的低溫工藝》，在低溫乙醇法的基礎(chǔ)上進行改進，控制溫 度、乙醇濃度、酸堿度，提取組分IV沉淀中殘留的白蛋白，每千克組分IV 沉淀可回收白蛋白50g左右。

熱乙醇法是將組分IV沉淀配制成蛋白液，加熱使蛋白液中的雜蛋白變 性固化，再通過加壓過濾使固液分離，將濾液超濾濃縮得到白蛋白粗制品， 如CN1660898A、CN1660903A公開的方法，但回收率也不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的提供一種從Cohn氏組分IV沉淀中回收白蛋白的方法，該 方法是在低溫乙醇法的基礎(chǔ)上，選擇適當(dāng)?shù)臏囟?、乙醇濃度、酸堿度的參 數(shù)組合，使白蛋白與其它蛋白分離，大大提高白蛋白回收率。

本發(fā)明方法包括以下步驟：

A.取組分IV沉淀，加入組分IV沉淀重量的8±0.5倍的0～2℃，重量濃 度0.75±0.03％的NaCl溶液，攪拌溶解后，用醋酸/醋酸鈉緩沖液和/或 NaHCO₃水溶液調(diào)整pH值至6.90±0.10，攪拌5-7小時成為反應(yīng)液；

B.用醋酸/醋酸鈉緩沖液調(diào)整反應(yīng)液pH值至5.70±0.05，降溫至 -0.5±0.5℃，噴霧加入體積濃度大于60％的乙醇，反應(yīng)液逐漸降低溫度至 -4.5±0.5℃，乙醇加入量為反應(yīng)液中乙醇的體積濃度達(dá)到40％，乙醇加完 后，將反應(yīng)液pH值調(diào)整在5.85-5.90，繼續(xù)攪拌1～3小時，靜置8小時以 上，然后將反應(yīng)液離心過濾，取濾液；

C.濾液用含0.4±0.1mol/L醋酸和體積濃度40±1.0％乙醇的醋酸-乙醇 混合溶液調(diào)節(jié)至pH值為4.70±0.10，攪拌1～3小時，在-9.0±1.0℃靜置8 小時以上，過濾，收集沉淀物即粗制白蛋白；

D.將粗制白蛋白純化、濃縮、巴氏病毒滅活，可配制成注射用人血白 蛋白。

在步驟A中，NaCl溶液最好分兩次加入，第一次加入組分IV沉淀重量 的2～4倍，反應(yīng)液攪拌成糊狀，再補加剩余的NaCl溶液。

噴霧加入的乙醇體積濃度優(yōu)選為75～95％。

本發(fā)明方法通過選擇pH值、乙醇濃度、酸堿度和溫度，使組分IV沉淀 中的白蛋白與其它蛋白充分分離，每公斤組分IV沉淀可制得白蛋白 110～120克，使血漿中白蛋白的總提取率提高到93％以上。

具體實施方式

一、組分IV沉淀的解凍及溶解

從-30℃以下冷庫中取出組分IV沉淀，稱重后置于潔凈的不銹鋼反應(yīng)罐 中，向反應(yīng)罐中泵入組分IV重量的3倍的0～2℃，0.75wt％的NaCl溶液， 攪拌溶解，反應(yīng)液成為糊狀。

完全溶解后，將反應(yīng)液pH值調(diào)至6.90±0.10，并在該pH條件下攪拌 5～7小時，攪拌速度為1400～1500rpm。

再補加組分IV重量的5倍的0-2℃，0.75wt％的NaCl溶液，充分?jǐn)嚢? 均勻。

二、沉淀分離其它蛋白

向反應(yīng)液中噴霧加入pH值4.0的醋酸/醋酸鈉緩沖液，加入速度 150～200ml/min，將反應(yīng)液pH值調(diào)至5.70±0.05，將反應(yīng)液溫度降至 -0.5±0.5℃。

噴霧加入95％(v/v)乙醇，反應(yīng)液逐漸降溫至-4.5±0.5℃，乙醇加入 量為反應(yīng)液中乙醇的體積濃度為40％。