[發明專利]1-O-乙酰大花旋覆花內酯提取物的制備方法

無效

• 申請號: 201010101557.6
• 申請日: 2010-01-27
• 公開（公告）號: CN101787380A
• 公開（公告）日: 2010-07-28
• 發明（設計）人: 于樹宏;李倩;查建蓬;詹文紅
• 申請（專利權）人: 河北醫科大學
• 主分類號: C12P17/04
• 分類號: C12P17/04;C07D307/83
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種1-O-乙酰大花旋覆花內酯提取物的制備方法，包括如下步驟：

A、旋覆花無菌苗的培養：取旋覆花種子，消毒后培養獲得無菌幼苗；

B、懸浮細胞、愈傷組織、毛狀根或黃化苗的獲得：

①愈傷組織的獲得：切取步驟A中培養的旋覆花無菌苗任一外植體材料，劃傷表面以形成傷口，接入MS+0.05～0.15mg/L?CPPU+0.5～1.5mg/L?6-BA+0.2～1.0mg/L?NAA培養基，黑暗或弱光條件下誘導愈傷組織的形成；

②懸浮細胞的獲得：將①中獲得的疏松、生長迅速的淡黃色愈傷組織團塊培養于MS+0.05～0.15mg/L?CPPU+0.5～1.5mg/L?NAA固體培養基中，連續繼代3～5次；將生長旺盛、質地疏松的顆粒狀白色愈傷組織，繼代于液體培養基MS+0.05～0.15mg/L?CPPU+0.5～1.5mg/L?NAA?中，得到懸浮細胞系；培養溫度：23～27℃，搖床轉速：120～140r·min^-1，黑暗或弱光培養；

③毛狀根的獲得：切取步驟A中培養的旋覆花無菌苗任一外植體材料，劃傷表面造成傷口，置于已活化好的發根農桿菌菌液中浸泡5sec～15min，取出吸干表面菌液，接入MS培養基中，溫度23～27℃，黑暗培養；

④黃化苗的獲得：切取步驟A中培養的旋覆花無菌苗的自然根2～5cm，置于MS培養基中，5～10天后自然根上直接分化出黃化苗，將其分離并繼代于MS培養基中，黑暗培養；

C、1-O-乙酰大花旋覆花內酯的提取：將獲得的懸浮細胞、愈傷組織、毛狀根、黃化苗、無菌苗或無菌苗自然根中的一種或幾種的混合物，用于提取1-O-乙酰大花旋覆花內酯。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于旋覆花種子來自于野生的旋覆花。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于還進一步包括如下步驟，將步驟A獲得的無菌苗先接種于MS培養基中，生長幾天后，再繼代于MS+0.5％(質量比)?活性炭培養基中增殖培養。

4.如權利要求3所述的方法，其繼代培養條件為：

溫度：23～27℃，濕度：60～70％，光強：28～32μmol/(m².s)，光照時間：13～15h/d。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于還進一步包括如下步驟，將步驟B①中的MS基本培養基中NH₄NO₃和KNO₃的濃度均調整為2～5g/L，其它成分保持不變，獲得疏松、生長迅速的淡黃色愈傷組織團塊。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述發根農桿菌為ATCC15834。

7.如權利要求1～6任一所述的方法，其特征在于將所述的懸浮細胞、愈傷組織、毛狀根、黃化苗、無菌苗或無菌苗自然根中的一種或幾種的混合物，在40～45℃下烘干，研磨成粉末，95％乙醇回流2～4次，每次0.5～1小時，過濾，合并提取液，回收乙醇得浸膏；將浸膏懸于300～500ml水中，依次用200～400ml石油醚、氯仿萃取，萃取液濃縮，再經過柱層析分離、濃縮、結晶、冷凍干燥，即得到1-O-乙酰大花旋覆花內酯提取物。

8.如權利要求1～6任一所述的方法，其特征在于進一步將步驟B中獲得的組織培養物利用植物生物反應器進行大規模培養，用于1-O-乙酰大花旋覆花內酯的提取。?