[發明專利]用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法

有效

• 申請號: 201010101434.2
• 申請日: 2010-01-27
• 公開（公告）號: CN102146431A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 計皖
• 申請（專利權）人: 寧夏鼎實生物鑒定中心(有限公司)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 寧夏專利服務中心 64100
• 代理人: 葉學軍

技術領域：

本發明涉及生物DNA檢測技術的應用，特別是一種用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法。

背景技術：

世界上的羊絨制品主要有綿羊絨和山羊絨兩種。因為山羊絨比綿羊絨細膩、柔軟、保暖性好，所以它的質量和價格都高于綿羊絨。少數不法之徒為牟取暴利人為地將綿羊絨摻入山羊絨，嚴重地損害了消費者利益。中國現有的山羊絨和綿羊絨的鑒定辦法是用顯微鏡觀察羊絨纖維的結構，利用其表面結構的不同來區分二者。

現有技術的最明顯的缺陷在于：1.鑒定的主觀性：鑒定全靠技術人員的經驗判斷，沒有任何科學數據；2.鑒定方法的不確定性：鑒定方法全靠定性描述，他人很難重復；3.無法鑒定深度處理過的羊毛。深度處理過的羊毛，如深度染色等，因為羊毛結構或光學特性發生了變化，現有方法無法鑒定。

從進化來看，山羊(Capra?hircus)和綿羊(Ovis?aries)屬于不同的屬，他們大約在5至8百萬年前就在生殖上相互分離了，他們的DNA有相當大的差異。

發明內容：

本發明的目的是克服現有技術之不足，提供一種用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，本發明的目的按照下述方案實現：

用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，其檢測過程為：先從待測樣品上提取DNA，再用綿羊或山羊探針進行實時聚合酶鏈式反應，最后對反應結果進行數值分析得出樣品中山羊絨或綿羊絨的含量；

上述實時聚合酶鏈式反應的過程為，先制備綿羊TaqMan?MGB探針和山羊TaqMan?MGB探針，在試管內，分別與待測樣品DNA進行實時聚合酶鏈式反應，反應所加試劑有：1xPCR緩沖液、MgCl₂、dNTP、PCR正向引物、PCR反向引物、TaqMan?MGB探針、GoldTaq?DNA聚合酶、DNA樣品，反應溫度95℃，11分鐘，40個循環，每個循環，94℃?30秒，65℃?30秒，反應過程中實時測定試管內液體的相對熒光量；

上述綿羊TaqMan?MGB探針為：FAM-ataattataaaaacaaaa-MGB，山羊TaqManMGB探針為：FAM-ataattacagaaacaaaa-MGB，其中，FAM是熒光染料6-carboxyfluorescein的縮寫，MBG是猝光劑dihydrocyclopyrroloindole?tripeptideMinor?Groove?Binder的縮寫；

上述山羊絨含量的分析過程為：先制備不同山羊DNA濃度的標準樣，與山羊TaqMan?MGB探針進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對熒光量，根據結果制出標準曲線或歸納線性方程式，對待測樣品在同等條件下進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對熒光量，對照結果可以得出樣品中山羊絨含量；

上述綿羊絨含量的分析過程為：先制備不同綿羊DNA濃度的標準樣，與綿羊TaqMan?MGB探針進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對熒光量，根據結果制出標準曲線或歸納線性方程式，對待測樣品在同等條件下進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對熒光量，對照結果可以得出樣品中綿羊絨含量。

本發明從根本上克服了現有技術的主觀性，不確定性，使得鑒定深度加工的含羊絨制品成為現實，羊毛、羊絨鑒定從一門藝術變成了現代科技。

附圖說明：

圖1是山羊和綿羊線粒體DNA基因片段序列比較圖；

圖2是TaqMan?MGB反應的圖解圖；

圖3是綿羊毛DNA樣品與山羊或綿羊的TaqMan?MGB探針反應結果圖；

圖4是山羊毛DNA樣品與山羊或綿羊的TaqMan?MGB探針反應結果圖；

圖5是不同濃度的山羊DNA在山羊TaqMan探針中的反應結果圖；

圖6是山羊DNA量的對數與其Ct作圖得到的標準曲線圖；

圖7是綿羊DNA量的對數與其Ct作圖得到的標準曲線圖；

具體實施方式：

通過系統比較山羊和綿羊線粒體DNA，發現其12S?rRNA基因是一個能區分山羊和綿羊的優良檢測目標。如附圖1所示，“Query”是綿羊的12S?rRNA基因片段，“Sbjct”是山羊的12S?rRNA基因片段，他們之間相同的堿基用豎線標出，而不同的堿基則用空格標出。

在上述堿基序列第238和240位置處綿羊和山羊DNA產生了變異，分別從T變成了C和從A變成了G。由此，我們訂制了綿羊和山羊專一的TaqMan?MGB探針，如下：

綿羊TaqMan?MGB探針：FAM-ataattataaaaacaaaa-MGB