[發明專利]小分子RNA的調控位點及其應用

無效

• 申請號: 201010101254.4
• 申請日: 2010-01-26
• 公開（公告）號: CN102304520A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 周明;顧連峰;劉春艷;崔霞;宋顯偉;曹曉風
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/113
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及小分子的調控位點，通過對調控位點的改變，能夠控制基因的表達。

技術背景：

miRNA和siRNA的研究是近年來國際生命科學研究的熱點之一。具有調節功能的非編碼小分子RNA是指長度為21-24nt左右，大多在進化上具有序列保守性的RNA分子。它們不編碼蛋白質，而是以RNA的形式，在轉錄后水平上通過降解mRNA或抑制其翻譯，參與調節真核生物染色體結構的維持、防御病毒及調控生長發育等過程。小分子RNA的發現不僅揭示了困擾科學家們多年的基因沉默現象的本質，還改變了人們對基因的傳統認識，特別是miRNA的發現是近年來生命科學研究的一個重大突破，小分子RNA在2002和2003連續兩年被《Science》雜志評為“年度十大科技進展”。隨著對小分子RNA研究的深入，近幾年又發現有新的小分子種類，例如trans-acting?siRNA(ta-siRNA)和天然順式排列的反義RNA(natural?cis-antisense?RNA)介導產生的nat-siRNA參與植物的發育調控和逆境反應，這些新發現使我們認識到小分子RNA的存在可能具有更為廣泛的作用。

大量的實驗證據表明miRNA對動植物的多種生命現象具有重要的調控作用，在植物中主要表現在花的形態建成、開花時間的調控、維管束發育、根冠細胞的形成和葉型的發育等方面。在擬南芥中，某些miRNA的表達量在高鹽及營養等逆境條件下會明顯改變，表明miRNA還參與植物抗逆性反應等生理過程的調控此外，miRNA還介導反式作用的ta-siRNA的合成而間接地參與植物發育調控(Yoshikawa?et?al.，2005)，以miRNA390為例，miRNA390摻入到RICS復合體后可以指導TAS3轉錄本的切割，TAS3并不編碼蛋白質，而是ta-siRNA的前體。TAS3被切割后產生固定的5’或者3’末端，經過RDR6反轉錄，形成雙鏈的TAS3RNA，在DCL4的作用下，產生TAS3ta-siRNA并指導靶基因ARF3mRNA的降解。由于TAS3ta-siRNA作用的靶mRNA不是它自身編碼的TAS3位點，而是以反式作用于ARF3，4mRNA，顧名思義這類siRNA為反式作用的siRNA(trans-acting?siRNA)。這類新的siRNA的發現，不僅使我們認識到了miRNA的新功能，更使我們認識到小分子RNA的存在可能具有更為廣泛的作用。

水稻是我國最重要的糧食作物之一，關系到我國糧食安全以及人民生活的基本保障。水稻育種一直是現代育種學家關注的焦點問題之一。在我國水稻蟲害日益猖獗，但因水稻缺乏抗蟲基因而只好依賴于化學殺蟲劑來防治，這樣就增加了稻作成本并污染了生態環境；白葉枯病是水稻三大病害之一，目前我國雜交水稻大多數組合不抗白葉枯病；稻瘟病是水稻三大病害之首，目前尚未有效果好的抗稻瘟病的基因被發現。水稻基因組測序已經完成，如何利用測序基因尋找高效的抗蟲抗病基因一直是現代生物學和育種學家探索的問題。

發明內容：

本發明包含了miRNA的10個靶位點，通過突變這些靶位點可以調控基因的表達，為篩選高效的抗病抗蟲基因提供了豐富的資源。

本發明所提供的miRNA的識別位點，是長度為18-24nt的脫氧核苷酸序列，這些序列具有以下特性：

1)序列表中的SEQ?ID?NO：1

序列表中的SEQ?ID?NO：1由20個脫氧核苷酸序列組成，是基因Os01g69830、Os08g41940、Os09g32944、Os06g23650被osa-miR156識別的位點，在體內osa-miR156通過識別SEQ?ID?NO：1位點切割，實現對Os01g69830、Os08g41940、Os09g32944、Os06g23650的調控。

2)序列表中的SEQ?ID?NO：2

序列表中的SEQ?ID?NO：2由22個脫氧核苷酸序列組成，是基因Os03g02970被osa-miR162識別的位點，在體內osa-miR162通過識別SEQ?ID?NO：2位點切割，實現對Os03g02970的調控。

3)序列表中的SEQ?ID?NO：3

序列表中的SEQ?ID?NO：3由21個脫氧核苷酸序列組成，是基因Os03g48970被osa-miR169識別的位點，在體內osa-miR169通過識別SEQ?ID?NO：3位點切割，實現對Os03g48970的調控。

4)序列表中的SEQ?ID?NO：4