[發明專利]OsmiR528的調控位點及其應用

無效

• 申請號: 201010101183.8
• 申請日: 2010-01-26
• 公開（公告）號: CN102134571A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 楊榮新;李平川;劉春艷;曹守云;曹曉風
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A01H5/00
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技術領域：

本發明涉及OsmiR528的調控位點，通過對調控位點的改變，獲得能夠提高作物抗逆性的轉基因農作物。

技術背景：

miRNA和siRNA的研究是近年來國際生命科學研究的熱點之一。具有調節功能的非編碼小分子RNA是指長度為21-24nt左右，大多在進化上具有序列保守性的RNA分子。它們不編碼蛋白質，而是以RNA的形式，在轉錄后水平上通過降解mRNA或抑制其翻譯，參與調節真核生物染色體結構的維持、防御病毒及調控生長發育等過程。小分子RNA的發現不僅揭示了困擾科學家們多年的基因沉默現象的本質，還改變了人們對基因的傳統認識，特別是miRNA的發現是近年來生命科學研究的一個重大突破，小分子RNA在2002和2003連續兩年被《Science》雜志評為“年度十大科技進展”。隨著對小分子RNA研究的深入，近幾年又發現有新的小分子種類，例如trans-acting?siRNA(ta-siRNA)和天然順式排列的反義RNA(natural?cis-antisense?RNA)介導產生的nat-siRNA參與植物的發育調控和逆境反應，這些新發現使我們認識到小分子RNA的存在可能具有更為廣泛的作用。

大量的實驗證據表明miRNA對動植物的多種生命現象具有重要的調控作用，在植物中主要表現在花的形態建成、開花時間的調控、維管束發育、根冠細胞的形成和葉型的發育等方面。在擬南芥中，某些miRNA的表達量在高鹽及營養等逆境條件下會明顯改變，表明miRNA還參與植物抗逆性反應等生理過程的調控此外，miRNA還介導反式作用的ta-siRNA的合成而間接地參與植物發育調控(Yoshikawa?et?al.，2005)，以miRNA390為例，miRNA390摻入到RICS復合體后可以指導TAS3轉錄本的切割，TAS3并不編碼蛋白質，而是ta-siRNA的前體。TAS3被切割后產生固定的5’或者3’末端，經過RDR6反轉錄，形成雙鏈的TAS3RNA，在DCL4的作用下，產生TAS3?ta-siRNA并指導靶基因ARF3mRNA的降解。由于TAS3ta-siRNA作用的靶mRNA不是它自身編碼的TAS3位點，而是以反式作用于ARF3，4mRNA，顧名思義這類siRNA為反式作用的siRNA(trans-acting?siRNA)。這類新的siRNA的發現，不僅使我們認識到了miRNA的新功能，更使我們認識到小分子RNA的存在可能具有更為廣泛的作用。

雖然小分子RNA在理論上的研究已經取得了巨大的進步，但是何如在生產上利用小分子RNA，為現代農業服務，產生經濟價值是現代生物領域的一大難題。本發明通過對miRNA528識別位點的研究，獲得了能夠提高植物抗逆性的DNA序列，農作物的性狀改良提供基因資源具有重要的意義

發明內容：

本發明的目的是通過突變靶基因的OsmiR528的識別位點，獲得一種新的DNA序列528Tm，把該序列構建到表達載體上轉化農作物，獲得的轉基因株系具有提高作物抗逆性的功能。

本發明所提供的OsmiR528的識別位點，包括5個基因5個識別序列，這些序列具有以下特性：

1)序列表中的SEQ?ID?NO：1

序列表中的SEQ?ID?NO：1由24個脫氧核苷酸序列組成，是基因Os06g06050被OsmiR528識別的位點，在體內OsmiR528通過識別SEQ?ID?NO：1位點切割，實現對Os06g0605的調控。突變OsmiR528的識別位點，獲得528Tm基因，構建528Tm的表達載體pcmabi1300-528Tm，轉化農桿菌菌株，利用該菌株轉化植物，獲得轉基因植株。528Tm在植物體內能夠避免OsmiR528對正常靶基因的負調控，從而起到真正過表達靶基因的作用。

2)序列表中的SEQ?ID?NO：2

序列表中的SEQ?ID?NO：2由24個核苷酸序列組成，是基因Os06g37150被OsmiR528識別的位點，在體內OsmiR528通過識別SEQ?ID?NO：2位點切割，實現對Os06g37150的調控。突變OsmiR528的識別位點，獲得528Tm基因，構建528Tm表達載體pcmabi1300-528Tm，轉化農桿菌菌株，利用該菌株轉化植物，獲得轉基因植株。528Tm在植物體內能夠避免OsmiR528對正常靶基因的負調控，從而起到真正過表達靶基因的作用。

3)序列表中的SEQ?ID?NO：3