[發明專利]一種采用重組大腸桿菌生產氧化型PVA水解酶的方法

有效

• 申請號: 201010100612.X
• 申請日: 2010-01-25
• 公開（公告）號: CN102134563A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;楊鈺;張東旭
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種氧化型PVA水解酶(oxidized?polyvinyl?alcohol?hydrolase，EC3.7.1.7，簡稱OPH)的生產方法，特別是一種采用大腸桿菌生產氧化型PVA水解酶的方法，屬于紡織生物技術領域。

背景技術

PVA(全稱polyvinyl?alcohol)，即聚乙烯醇，是一種人工合成的水溶性的高分子化合物。憑借其在物理性質：黏度、柔韌性、抗拉強度、彈性、pH穩定性等方面的優良特性，PVA可用于生產涂料、粘合劑、纖維漿料、紙品加工劑、乳化劑、分散劑、薄膜等產品，現已廣泛應用于紡織、造紙等輕工業領域。

但是伴隨著PVA在工業上的大量應用，尤其是紡織工業中，在退漿的時候大量的PVA也隨著污水進入到河流當中，其穩定的物理性質使其很難被降解，因此造成很大的污染。目前在紡織工業中，傳統的退漿過程是用高溫加酸/堿或是用氧化劑來破壞PVA的長鏈結構使其降解，但是與此同時也對棉纖維造成了較大的損傷，而且十分浪費能源！于是人們尋求運用生物降解的方法來處理PVA，這樣做既節約能源又環保。

一般來講，PVA的生物降解的分兩步進行一般來講，PVA的降解主要是兩步反應：①在PVA脫氫酶(PVADH)或者仲醇氧化酶(SAO)的催化作用下，PVA上的羥基被氧化成羰基，形成β-二酮結構，即氧化型PVA(oxidized?PVA)；②在β-二酮水解酶(BDH)或者氧化型PVA水解酶(OPH)的催化作用下，將β-二酮鍵切開形成一分子的羧酸結構和一分子甲基酮結構。

2005年，Wilailak?Klomklang等人報道了Sphingopyxis?sp.113P3中OPH的基因序列，該序列含有1095bp，編碼364個氨基酸殘基，其中包括一個信號肽和一個成熟蛋白質(WilailakKlomklang?et?al，Biochemical?and?molecular?characterization?of?a?periplasmic?hydrolase?foroxidized?polyvinyl?alcohol?from?Sphingomonas?sp.strain?113P3)。在進一步的研究發現，OPH為胞外酶，分布在周質空間內，呈組成型表達，底物特異性比較高，僅對氧化型PVA和對硝基苯酚乙酸酯(PNPA，氧化型PVA的替代物)有催化效果。OPH的氨基酸序列中有脂肪酶共識學列，而且可以被絲氨酸蛋白特異性抑制劑(PMSF)完全抑制，據此推斷OPH為絲氨酸型水解酶。但是在做oph基因克隆表達的時候，重組蛋白卻沒有催化氧化型PVA和對硝基苯酚乙酸酯(PNPA，氧化型PVA的替代物)的活性。而且OPH底物特異性較強，僅對氧化型PVA和PNPA有催化效果。

國外對PVA水解酶的研究主要側重于其基因報道和降解機理上，而對PVA水解酶酶活的提高以及進一步的工業化生產研究很少，鑒于PVA水解酶廣闊的應用前景而且目前PVA酶活較低的現實情況，構建出高產、有效分泌到胞外及誘導方式廉價的基因工程菌是急待解決的問題。

我國對PVA降解的研究主要側重于發酵優化，即從自然界篩選菌株進而進行發酵優化或者是進行混菌發酵，以此來提高PVA水解酶酶活。但是，幾乎沒有關于PVA水解酶基因工程菌的研究報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種采用大腸桿菌生產表達氧化型PVA水解酶(OPH)的方法，其特征在于，化學合成氧化型PVA水解酶的基因序列(oph)，構建重組質粒pET-20b(+)-oph，該基因工程菌為將重組質粒轉化入重組大腸桿菌(Escherichia?coli)JM109，得到分泌表達氧化型PVA水解酶的基因工程菌JM109-oph，發酵培養3-4天。

所述氧化型PVA水解酶的基因(oph)序來源于Sphingopyxis.sp.113P中含oph基因的操縱子(GenBank?No.AB190288)，替換掉oph基因中的一個EcoRI限制性內切酶位點，將EcoR?I限制性內切酶和Nco?I限制性酶切位點分別加在含有氧化型PVA水解酶基因的DNA序列(oph)的5′端及3′端，修飾后的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO：1。

SEQ?ID?NO：1

CCATGGATGTTCAAACCAGTTGTCAAGTCCCGTTCCTCTCGTTCTTTTTGTTACCT

GGCAGGTTGTCTGGCTATGGTCGCTGCTACTCTGTCCTCTACTGCACAGGCTAAAT