[發明專利]一種共聚焦光學掃描儀

有效

• 申請號: 201010100382.7
• 申請日: 2010-01-25
• 公開（公告）號: CN101795339A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 賴博
• 申請（專利權）人: 賴博
• 主分類號: H04N1/04
• 分類號: H04N1/04;G01N21/01;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種共聚焦光學掃描儀，特別涉及使用電荷耦合裝置(charge?coupled?device， CCD)和互補型氧化半導體(Complementary?Metal?Oxide?Semiconductor，CMOS)等面陣探測器作為檢 測器的多針孔共聚焦光學掃描儀。本發明主要應用于生物醫學顯微成像領域，也可用于材料 研究和集成電路芯片檢測成像。

背景技術

隨著細胞生物學研究的深入，顯微鏡成像的應用越來越普遍，熒光顯微成像更是受到廣 泛的重視，尤其是活細胞熒光實時成像。但是，普通寬場熒光顯微鏡存在軸向分辨率低的問 題，尤其在觀察一些較厚的樣品時，此問題尤為明顯，甚至限制了熒光顯微鏡的使用。為了 解決普通寬場熒光顯微鏡軸向分辨率低的問題，獲得理想的軸向分辨率，獲取清晰的熒光圖 像，尤其是三維熒光圖像，科學家設計、制造了很多裝置，如目前應用較多的激光掃描共聚 焦顯微鏡。這類激光掃描共聚焦顯微鏡的特點是通過一個針孔形成點光源掃描照明樣品，樣 品發射的熒光穿過針孔被光電倍增管采集，并通過計算機還原圖像。因此，獲得的圖像具有 很高的軸向對比度。但是E.Wang和K.W.Dunn(Journal?of?Microscopy，Vol.218，Pt?2May?2005， pp.148-159)指出，因為只有一個針孔用以形成照明光束，并通過振鏡驅動光束掃描照明樣品， 所以該類單點共聚焦激光掃描儀成像速度慢；同時光電倍增管靈敏度相對較低，需要較強的 激光照明，導致樣品被激光傷害，所以無法應用于活細胞共聚焦成像，尤其是活細胞實時共 聚焦成像。科學家一直在尋找解決的方法，以使共聚焦成像適用于活細胞成像。據文章True confocal?resonant?scanning：a?better?solution?for?high-speed?multifluorescence?optical?sectioning (Nature?Methods?Application?Notes?2006)報道，目前最新的單點共聚焦激光掃描儀技術共振 掃描在較低的分辨率，如512×512下，可獲得25赫茲的掃描速度。但對于高分辨率下的掃 描速度，共振掃描技術仍然無法提高，所以應用還是受到限制。而且由于未能改善檢測靈敏 度低的問題，共振掃描無法從根本上解決單點共聚焦激光掃描儀在活細胞成像領域中面臨的 問題。

因為單點共聚焦激光掃描儀存在的問題無法得到根本解決，科學家采用了轉盤式共聚焦 掃描儀，即Nipkow?disk?confocal?scanner，以提高掃描儀的掃描速度，并使用CCD、EMCCD 和CMOS等檢測器來提高檢測靈敏度。轉盤式共聚焦掃描儀最重要的特征是：1)一個以恒定 速度旋轉的、不透光的圓盤，圓盤上按照一定的規則排列了很多針孔或夾縫，針孔或夾縫可 使來自光源的光形成很多相互獨立的掃描照明光束，并通過物鏡投射在成像焦面的樣品上； 當轉盤式共聚焦掃描儀工作時，圓盤高速旋轉使掃描光束快速地、持續地掃描照明成像焦面 的樣品，樣品發射的熒光通過針孔或夾縫被檢測器采集。2)使用CCD、EMCCD和CMOS 等面陣檢測器作為圖像采集單元，檢測器的曝光時間跟據觀察的樣品、照明強度的不同而改 變。由于其本身的結構原因，轉盤共聚焦光學掃描儀無法完全避免以下三個問題：

一、光源發射的光只有2％左右可以透過針孔并照在樣品上，其余98％的光會被轉盤的 不透光部分反射，形成雜散光。當檢測器曝光成像時，部分雜散光會被探測到，產生較高的 背景噪聲，降低圖像質量。尤其當樣品的熒光強度較弱時，高強度的照明光產生的雜散光背 景噪聲甚至會掩蓋樣品的熒光信號，即使延長檢測器的曝光時間也無法檢測到樣品發出的信 號。為了解決這個問題，專利US4927254通過改變轉盤轉軸方向，使轉盤轉軸與物鏡的光軸 有一個夾角。當光源發射的光照到轉盤時，轉盤不透光部分反射的大部分入射光就會偏離物 鏡的光軸，不被檢測器探測，所以很好地降低了該背景噪聲。但是，該專利也引入了新的問 題：由于轉盤轉軸與物鏡的光軸存在夾角，轉盤上的針孔并不完全是處于物鏡的同一成像焦 面，從而導致圖像變形，即使通過光學配件糾正，也只能部分解決圖像變形的問題。專利 EP0539691A2則通過在針孔轉盤和光源之間增加一個微透鏡轉盤，將光源發射的光分束、獨 立聚焦在各個針孔，避免了轉盤反射光，較好地解決了轉盤反射光的背景噪聲等問題。