[發明專利]一株枯草芽孢桿菌及其在仿刺參育苗過程中的應用

無效

• 申請號: 201010100303.2
• 申請日: 2010-01-25
• 公開（公告）號: CN102134558A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 蘇浩;劉衛東;周遵春;王志松;王軍;鮑相勃
• 申請（專利權）人: 遼寧省海洋水產科學研究院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01K61/00;A01N63/02;A61K35/74;A01P1/00;A61P43/00;C12R1/125
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技術領域

本發明涉及一株枯草芽孢桿菌的分離及其在仿刺參育苗中的使用方法，該菌株能有效抑制水產生物養殖過程海水中，弧菌等致病菌繁殖并能促進仿刺參苗的生長。

背景技術

目前，隨著高密度海水養殖業快速發展和環境污染的加劇，養殖動物的病害已成為我國乃至全世界海水養殖業發展的主要問題。公認的養殖動物的病害防治由藥物來控制，由于抗生素的使用，養殖動物的生態環境受到破壞，養殖動物的生長受到抑制，食品安全無法保障，因此抗生素的使用受到嚴格限制。弧菌作為重要的病原菌，可引起多種海水養殖品種的病害爆發。使用微生物制劑可以提高養殖動物的免疫力，抑制病原微生物，從而減少疾病的發生，同時具有無殘毒、無抗藥性等優點。

發明內容

本發明所涉及枯草芽孢桿菌(編號Sn，保藏單位：中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心；保藏日期2009年12月03日；保藏編號3498)，系2008年4月從大連海域捕獲魚類腮部分離獲得。分離方法為：取大連黑石礁海域捕獲的黑鲪(許氏平魷)活體，剪取腮部勻漿，將勻漿置于80℃恒溫水浴中20分鐘后均勻涂布于LB培養基上，待長出菌落后，在LB培養基上對菌落進行進一步分離純化。純化后的菌落進行16SrDNA擴增測序，經過序列比對和生理生化鑒定，得到純化一株細菌，經鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)。實驗室對其檢測結果如下：

(1)形態特征菌體呈桿狀，革蘭氏陽性，可運動，周生鞭毛。芽孢中生，橢圓形，孢子囊不膨大，無伴孢晶體。在LB平板上，菌落淡乳白色，圓形，邊緣整齊，表面濕潤，菌落粘稠。液體靜止培養時產生菌膜和菌環。

(2)生理生化特征過氧化氫酶和接觸酶陽性，明膠液化，水解淀粉，能在3-7％NaCl及45℃下生長，可利用檸檬酸鹽、葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、甘露醇，不能利用半乳糖、鼠李糖、甲酸鹽、乙酸鹽和丙酸鹽。根據《伯杰細菌鑒定手冊》等有關資料的描述，確定Sn菌株屬于枯草芽孢桿菌。

(3)16SrDNA序列比對運用通用引物，經PCR擴增得到該菌的16SrDNA序列，將所得結果在Genbank中進行同源比對，結果Sn菌株與Bacillus?subtilis?d的16SrDNA序列的同源性達到100％，說明Sn菌株屬于枯草芽孢桿菌。

(4)Sn菌株的抑菌特征用牛津杯法檢測Sn菌株對刺參的主要病原菌哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和燦爛弧菌(V.splendidus)的抑菌性，結果顯示，Sn菌株對上述3種弧菌均產生抑菌圈，即Sn菌株對這些病原有抑制作用。

在海參育苗中，通過大量實踐和科學化研究觀察，Sn能抑制有害微生物的增殖，特別是抑制海洋弧菌等致病菌的繁殖，由此達到防治疾病和提高海參苗免疫力的目的。通過這種芽孢桿菌的使用，不但避免了病原菌耐藥性的產生和藥物的殘留，而且菌體本身就是海參苗的餌料，具有促進海參苗的生長及提高海參苗產品質量的效果，更科學，更環保。同時本發明可以廣泛運用于漁業的養殖和生產的其他環節，可以降解，轉化，代謝養殖和生產過程中的代謝產物，營造良好的生態環境，改良、保全、修復水資源的生態環境，達到消減自身污染，減少藥物損害，降低成本，減輕養殖業對整體生態環境的污染，提高養殖產品品質。

為實現上述目的，本發明通過以下技術方案實現：在育苗過程中根據仿刺參不同發育階段的生活特點，采取不同的方式使用該菌。在仿刺參浮游幼體階段使用該菌時，向仿刺參幼體培育池中均勻潑灑該菌菌液，菌液使用量為20ml/m³，以達到抑制致病菌并促進仿刺參幼體生長發育的目的。在參苗附著變態后，以膨潤土為載體，將菌液與膨潤土充分混合后，將混合物投入參苗培育池內，菌液使用量為20ml/m³，菌液與膨潤土的比例為3∶1。

上述枯草芽孢桿菌Sn采用液體發酵技術制成菌液，其活菌含量大于10⁹cfu/ml。上述載體為粒徑小于200目的鈣基膨潤土，市場有售。

本發明的有益效果是：枯草芽孢桿菌Sn能抑制海洋弧菌等致病菌的生長，同時該菌也為參苗提供營養，對促進海參苗生長發育效果顯著。仿刺參幼體浮游階段，個體浮游于培育水體中，直接潑灑菌液能使菌體均勻分布于水體中，直接抑制水體中的致病菌并能被仿刺參幼體攝食；而仿刺參幼體附著后，主要棲息于附著基上。膨潤土對細菌有吸附作用，以膨潤土為載體，可以使菌體快速沉降到附著基上，在抑制附著基上致病菌繁殖的同時容易被仿刺參攝食。