[發明專利]化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法

無效

• 申請號: 201010100217.1
• 申請日: 2010-01-22
• 公開（公告）號: CN101748170A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 高文運;李恒;田潔;廖娟;王雪嬌;王輝;楊少青
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C07H3/08;C07H1/06
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 徐平

1.化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

(1)以縮水甘油為底物，以無機磷酸鹽為磷酸化試劑，水為溶劑，用化學法合成D，L-甘油3-磷酸或L-甘油3-磷酸；

(2)向步驟(1)的反應產物中加入過氧化氫酶和(L)-甘油磷酸氧化酶，再加入丙酮酸鈉、二價金屬離子、輔羧酶、磷酸三糖異構化酶、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶及酶保護劑；該反應體系的pH值為7.0-8.0，該反應體系在25～40℃下反應6-14h；反應過程中，色譜法檢測反應進行的程度；

(3)向步驟2)的反應產物中加入磷酸酶，25～40℃反應2-8小時；

(4)將步驟(3)的反應產物減壓蒸餾除去水分，殘留物以少量有機溶劑提取，得到含1-脫氧-D-木酮糖的有機溶劑提取液；

(5)在含1-脫氧-D-木酮糖的有機溶劑提取液中加入硅膠，室溫揮發除去溶劑，用柱層析法純化得到1-脫氧-D-木酮糖。

2.根據權利要求1所述的化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：步驟(1)縮水甘油是D，L-縮水甘油或L-縮水甘油；無機磷酸鹽是磷酸氫二鈉；縮水甘油與無機磷酸鹽的濃度比為1∶1～1∶5，反應體積為1-20mL，反應溫度為50～100℃，反應時間為1-5小時。

3.根據權利要求1所述的化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：步驟(2)加入過氧化氫酶100-200units；(L)-甘油磷酸氧化酶1-20units；丙酮酸鈉30-60mg、二價金屬離子2-10mM、輔羧酶1-5mM、磷酸三糖異構化酶10-30units、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶200-800μg；酶保護劑1-5mM。

4.根據權利要求1所述的化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：所述磷酸酶為酸性磷酸酶或堿性磷酸酶，用量為1-20單位。

5.根據權利要求1所述的化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：步驟(5)柱層析法純化的具體實現步驟是：

(5.1)用硅膠柱層析純化DX，所用硅膠為100-300目層析硅膠，流動相為丙酮∶氯仿∶＝1∶3～5∶1(v/v)或氯仿∶甲醇∶水＝8∶1∶0.1～2∶1∶0.1(v/v/v)；硅膠薄層層析檢測洗脫液，展開劑為丙酮∶氯仿＝3∶1(v/v)或氯仿、甲醇∶水＝3∶1∶0.1(v/v/v)，顯色劑為5％硫酸乙醇溶液，顯色方法為噴灑顯色劑后95-105℃加熱10-20分鐘；

(5.2)合并含有DX的洗脫液，減壓濃縮得到淡黃色粘稠油狀物即為1-脫氧-D-木酮糖，置低溫保存。

6.根據權利要求1或3所述的化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶是微生物來源的、含有6×Histag標簽的重組酶；二價金屬離子是Mg²⁺、Mn²⁺或Co²⁺；酶保護劑為β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇。

7.根據權利要求1所述的化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：所用色譜檢測方法為紙色譜法，介質為普通層析濾紙，展開劑為1M乙酸銨∶99％乙醇∶EDTA-Na₂＝70∶30∶1(v/v/v)，顯色劑為1-10％的硫酸乙二胺鹽水溶液；顯色方法為噴灑顯色劑后95-105℃加熱10-20分鐘。

8.根據權利要求1所述的化學法-酶法制備1-脫氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：所述有機溶劑為甲醇或95％乙醇。