[發明專利]一種尿液樣品的等電聚焦方法

有效

• 申請號: 201010042726.3
• 申請日: 2010-01-06
• 公開（公告）號: CN102116761A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 李順民;祁愛蓉
• 申請（專利權）人: 李順民;祁愛蓉
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 胡堅

技術領域

本發明專利申請涉及一種在對尿液樣品進行等電聚焦電泳的方法，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

凝膠電泳技術(gel?electrophoresis)基于電場中帶電蛋白質的遷移，是生物醫學領域常用的用來分離、鑒定和純化蛋白質的方法。其優點在于將蛋白質分離的同時將其純化，使研究者可以快速鑒定混合物中不同蛋白質的數量或者特定蛋白制備品的純度。而且，可以確定一個蛋白質的關鍵性質，如等電點和大概的分子質量。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)具有較高的分離能力，廣泛的用于蛋白質的分離和鑒定。聚丙烯酰胺作為分子篩，大致按蛋白質的荷質比成比例的減慢其遷移速度，遷移也受蛋白質形狀的影響。一種通常用來確定蛋白質純度和分子質量的電泳方法用到了十二烷基硫酸鈉SDS，SDS與大部分蛋白質結合的數量大致和蛋白質分子質量成比例，并且貢獻了大量凈負電荷，使蛋白質的本身電荷不再顯著并使每個蛋白質都有相似的荷質比。另外，SDS的結合改變了蛋白質的原始構型，大部分蛋白質都呈現相似的形狀，因此SDS-PAGE電泳幾乎僅根據質量來分離蛋白質，小分子多肽遷移的更快，因此該方法可以很好的根據未鑒定蛋白質的位置確定其分子質量。

等電聚焦電泳(IFE，isoelectric?focusing?electrophoresis)利用特殊的一種緩沖液(兩性電解質)在凝膠(常用聚丙烯酰胺凝膠)內制造一個pH梯度，電泳時每種蛋白質就將遷移到等于其等電點(pI)的pH處(此時此蛋白質不再帶有凈的正或負電荷)，形成一個很窄的區帶。

IFE的基本原理：在IFE的電泳中，具有pH梯度的介質其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等于聚焦蛋白質分子的等電點(p1)。同理，位于酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區帶。

兩性電解質載體與支持介質：理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩沖能力及電導，前者保證pH梯度的穩定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質應有相似的電導系數從而使整個體系的電導均勻。兩性電解質的分子量要小，易于應用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質分開，而且不應與被分離物質發生反應或使之變性。pH梯度制作利用的兩性電解質(ampholyte，商品名為ampholine)，是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度。

在多種疾病中尿液蛋白質含量都會發生變化，因此檢測尿液樣品中蛋白質的含量在疾病的診斷和治療中都具有很重要的作用。對尿液樣品中的蛋白質進行檢測和分析的過程中，常常要用到雙向凝膠電泳技術。第一向為等電聚焦電泳，第二向為SDS-PAGE凝膠電泳，尿液是鹽含量相對較高的體液樣品，對于一些蛋白含量較低的腎病患者或是健康人，常需要大量樣品來濃縮提取蛋白，此時超常的鹽含量成了尿液樣品等電聚焦進行雙向凝膠電泳的最大障礙，因為鹽含量能嚴重影響聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳的等電聚焦結果。樣品中如果含有大量的鹽類，會影響檢測的準確性，所以實驗所得雙向凝膠電泳圖譜的質量和完整性直接與樣品制備中去除鹽類的質量有關。而且等電聚焦時電壓常需達到5000V以上，如果鹽含量過高，則聚焦時電流增大，常常超過50μA，這樣不僅會損壞膠條而且有被電流擊穿的危險。

用常規方法在等電聚焦電泳中預制pH3-10線性膠條，聚焦伏小時數(VHr)約60000VHr比較合適，聚焦的伏小時數可以根據聚焦的情況進行調整。常規使用的尿液等電聚焦程序為：第一步Step1-30或50v(10-12h)；第二步Step2-300或500v(1h)；第三步Step3-500或1000v(1h)；第四步Step4-8000v(1-2h)；第五步Step5-8000v(6h)至60000vhr，第六步Step6-500v任意時間。但除鹽效果不顯著，并且不易達到所需的伏小時數。

發明內容

本發明的目的是提供一種在對尿液樣品使用等電聚焦電泳時，除鹽效果明顯，并且較容易達到所需要的聚焦伏小時數的方法。