[發明專利]一類熒光染料、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201010022414.6
• 申請日: 2010-01-05
• 公開（公告）號: CN102115610A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 彭孝軍;吳彤;樊江莉;孫世國
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C09B23/06
• 分類號: C09B23/06;C07D417/06;C07D413/06;C07D401/06;C07D421/06;G01N21/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 張宜紅

技術領域

本發明涉及精細化工領域中一類新的熒光染料、制備方法及其應用，特別是涉及一類單電荷含氮菁類熒光染料、其制備方法，以及利用該熒光染料、其綴合物或其組合物在生物染色方面的應用。

背景技術

熒光染料作為功能性色素在科學技術的各個領域得到廣泛應用，尤其在生命科學、臨床醫療診斷、免疫分析檢測等方面的研究在全世界備受矚目。目前，菲啶類(EB、PI)、吖啶類(A0)、咪唑類(Hoechst、DAPI)和花菁家族類(Cy、TOTO、SYTO)等商品化熒光染料在基因組學技術、核酸定量檢測、血細胞分析等領域中都起到了重要的作用。然而，這些染料都各自存在著應用的局限性。其一主要表現在大多熒光染料受限于固定細胞樣品。例如TOPRO、TOTO家族染料、溴乙錠(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通過增大細胞膜的通透性或類似使膜崩解的方法才能對生物樣品進行有效的熒光標記。然而，這種固定方法往往對細胞和生物組織真實形態的觀察有負面影響[Kozubek?S，Lukasova?E，Amrichova?J，Kozubek?M，Liskova?A，Slotova?J.Anal?Biochem?2000；282：29?38]。同時，溴乙錠等吖啶，菲啶類染料有很大的毒性和致癌性。其二，有相當一部分熒光染料的激發光處在紫外光區，如能夠專一識別脫氧核糖核酸(DNA)的熒光染料4’，6-二氨基-2-苯基吲哚啉化合物(DAPI)、Hoechst33258，Hoechst34580等，與DNA結合后，在紫外光激發放下產生藍色熒光。由于紫外光對細胞內的核酸、蛋白等組分會造成嚴重的損傷，因此這類熒光在熒光顯微技術中的使用受到光激發時間的限制[Davis?SK，Bardeen?CJ.Photochem?Photobiol?2003；77：675-679]。此外，在紫外區進行熒光檢測時，生物樣品在這個區間的吸收使光進入生物組織內部變得困難，同時生物樣品中某些成分的自發熒光形成很強的背景干擾，使檢測效率大大降低。因此，研究開發出具有良好熒光光譜性能，毒性小，活細胞通透性的新型熒光染料仍然是推動熒光分析技術和生命科學等領域發展的關鍵和核心。

在眾多種類的熒光染料中，菁類熒光染料以其波長范圍寬，摩爾消光系數大，熒光量子產率適中等優點，作為生物分子熒光探針、CD和VCD記錄材料、感光材料光敏劑、光電轉換材料等已被廣泛的應用。其中喹啉類不對稱菁類熒光染料與核酸有高度親和力，而與其他生物大分子基本不結合的特異性使其在基因組學技術、核酸定量檢測、血細胞分析等領域的應用中脫穎而出。該類化合物與核酸的結合方式包括靜電吸引、堿基對嵌入及溝槽結合。具體的結合方式與結合能力取決于該標識物的結構及其與核酸濃度的比例。不對稱菁類化合物中最典型的為TOTO及其類似物(YOYO)和衍生物類(TOPRPO)。TOTO(噻唑橙二聚體)、YOYO(惡唑黃二聚體)是由Glazer研究組開發的一類對核酸具有高度親和力的多正電荷不對稱菁類熒光染料，通過改變多亞甲基鏈的長度和兩端的芳香母核(噻唑、惡唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的結構可以得到不同的異二聚體類似物和衍生物。這類染料在溶液中幾乎無熒光，降低了檢測過程中的熒光背景干擾，與核酸結合后熒光增強。Jason等用溶液粘度測定法和原子力顯微鏡解釋了TOTO和YOYO與DNA的雙嵌入作用[J.A.Bordelon，K.J.Feierabend，S.A.Siddiqui，L.L.Wright.J.Phys.Chem.B，2002，106，4838-3843]。Fürstenberg等利用超快速熒光轉換和時間相關單光子計數法進一步闡述了熒光增強的動力學機理。[A.Fürstenberg，M.D.Julliard，T.G.Deligeorgiec，N.I.Gadjev.J.AM.CHEM.SOC.，2006，128，7661-7669]此類染料中的有些品種已經商品化了，如：SYTOX?Blue，TOTO，POPO，BOBO，YO-PRO等。但這些商品化的染料大部分分子較大，結構復雜，屬活細胞非通透性，只能應用于活體外核酸的識別與檢測。

發明內容

因此，需要開發新的熒光染料，該熒光染料應當具有以下優點：在不存在核酸時具有較低的熒光背景，與核酸結合后具有較高的熒光量子產率，且對核酸以外的生物分子無親和力；具有一定水平的水溶性，同時具有良好的細胞膜通透性；光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有較大差異。

在本發明的第一方面，本發明針對現有技術的不足，在其基礎上改進，提供了一類結構簡單、靈敏度高、長波長、且具有良好的細胞膜通透性的新化合物，其具有下列結構通式I：