[發明專利]檢測DNA堿基突變的方法

有效

• 申請號: 201010002602.2
• 申請日: 2008-04-07
• 公開（公告）號: CN101838688A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 王樹;賀芳
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

本申請是申請號為200810103458.4、申請日為2008年04月07日、發明創造名稱為“一種檢測DNA堿基突變的方法”的分案申請。

技術領域

本發明涉及一種檢測DNA中是否存在堿基突變的方法。

背景技術

近年來，DNA堿基錯配受到了大家的廣泛關注，研究表明，人類基因大約含有10⁹個堿基對。對DNA的物理和化學破壞都有可能導致DNA在復制過程中產生堿基錯配或誤配，雖然生物體自身存在強大的修復系統用于修復錯配，但是仍有部分錯配未被修復。由于一個堿基突變都有可能引發致命的癌癥以及基因相關疾病，所以對于DNA堿基錯配的檢測對于臨床診斷，基因表達分析和治療以及生物醫藥研究都具有重要的意義。

目前已有多種方法可用于DNA堿基錯配的檢測，其中大部分是基于DNA錯配會對DNA雙螺旋的穩定性產生較大影響的原理，利用寡核苷酸的特異性雜交來檢測DNA堿基錯配?；谏鲜鲈淼姆椒ň哂性砗唵蔚膬烖c，但存在步驟繁瑣、成本較高、靈敏度低的缺點，而且由于非特異性雜交的影響，導致上述方法選擇性降低，很難實現單個堿基突變的檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測DNA中是否存在堿基突變的方法。

本發明提供的檢測DNA中是否存在堿基突變的方法，依次包括以下步驟：

1)用熒光素標記單鏈多核苷酸M；所述M與待測DNA的正常序列完全互補且可以形成G-四聚體結構；

2)使熒光素標記的M形成G-四聚體結構；

3)將形成G-四聚體結構的M和溴乙錠混合，加入待測DNA和下述式(I)的化合物、同時設置加入由待測DNA的正常序列組成的DNA片段和下述式(I)的化合物的對照體系，按照如下方法確定待測DNA是否存在突變：若待測DNA反應體系的I_600nm/I_422nm小于等于對照體系的1.5±0.08，待測DNA存在堿基突變；若待測DNA反應體系的I_600nm/I_422nm等于對照體系的2.0±0.07，待測DNA不存在堿基突變；所述I_600nm為發射波長為600nm的發射峰的熒光強度；所述I_422nm為發射波長為422nm的發射峰的熒光強度；

式(I)；

式(I)中，m＝1～10，n＝2～100；R₁，R₂，R₃，R₄＝C_XH_2X+1或-O(C_XH_2X+1)，x＝1～10；R₅＝C_XH_2X+1，x＝1～3；R₆＝Br、Cl、I、CF₃COO或CH₃COO。

所述式(I)中，m＝6、n＝6、R₁＝H、R₂＝H、R₃＝H、R₄＝H、R₅＝CH₃、R₆＝Br。

所述式(I)中，m＝6、n＝6、R₁＝H、R₂＝H、R₃＝H、R₄＝H、R₅＝CH₂CH₃、R₆＝I。

本發明提供的檢測DNA中是否存在堿基突變的方法，還可依次包括以下步驟：

1)制備單鏈多核苷酸D1，所述D1與待測DNA的正常序列完全互補；

2)制備單鏈多核苷酸D2，用熒光素標記序列D2；所述D2能形成發卡DNA，莖環與D1完全互補，莖干與D1至少有6nt不互補，且莖干區含有限制性內切酶的酶切位點；

3)將D1和D2混合，再加入待測DNA，然后加入與D2莖干區的酶切位點相應的限制性內切酶，再加入下述式(I)的化合物；同時設置用待測DNA的正常序列組成的DNA片段取代待測DNA的體系作為對照；