[發(fā)明專利]利用靶雜交及檢測引物進(jìn)行靶檢測

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980163265.0
• 申請日: 2009-11-28
• 公開（公告）號: CN102782150A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 千鐘潤;黃仁澤;李榮祚
• 申請（專利權(quán)）人: SEEGENE株式會社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 羅菊華

1.一種利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應(yīng)以及3’-延長反應(yīng)從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下的步驟：

步驟（a），對上述靶核酸序列與上述靶雜交及檢測引物進(jìn)行雜交，上述靶雜交及檢測引物包含：（i）雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及（ii）相互作用性標(biāo)記系統(tǒng)，其包含一個標(biāo)記或者多個標(biāo)記；

步驟（b），借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述靶雜交及檢測引物的5’-切割反應(yīng)以及3’-延長反應(yīng)的條件下，將上述步驟（a）的結(jié)果物與具有5’→3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進(jìn)行接觸，上述靶雜交及檢測引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性而切割，從而上述靶雜交及檢測引物放出上述標(biāo)記或者上述相互作用性標(biāo)記系統(tǒng)的至少一個標(biāo)記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；以及，

步驟（c），對上述信號進(jìn)行檢測，上述信號表示上述靶核酸序列的存在。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應(yīng)以及3’-延長反應(yīng)從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟（a）借助（i）上述靶雜交及檢測引物以及（ii）利用標(biāo)記探針來實施；上述標(biāo)記探針使其3’-末端發(fā)生變形來防止模板-依賴性核酸聚合酶引起的延長，上述靶雜交及檢測引物進(jìn)行雜交的位點的下游位點進(jìn)行雜交，且，在步驟（b）中被切割而放出與上述標(biāo)記探針連接的標(biāo)記。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應(yīng)以及3’-延長反應(yīng)從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟（a）借助（i）上述靶雜交及檢測引物以及（ii）利用上游引物或者下游引物來實施；上述上游引物與上述靶雜交及檢測引物雜交的位點的上游位點進(jìn)行雜交，并且，與上述靶雜交及檢測引物具有相同的方向；上述下游引物與上述靶雜交及檢測引物雜交的位點的下游位點進(jìn)行雜交，且與上述靶雜交及檢測引物具有相同的方向。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應(yīng)以及3’-延長反應(yīng)從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在反復(fù)循環(huán)之間包括變性過程，還包括至少反復(fù)進(jìn)行兩次上述步驟（a）-步驟（b）或者步驟（a）-步驟（c）的步驟，以便擴增用于表示靶核酸序列存在的信號。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應(yīng)以及3’-延長反應(yīng)從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟（c）的上述檢測以實時方式、終-點方式或者預(yù)定時間間隔方式來實施。