[發明專利]硫醇基官能化試劑及其用途

有效

• 申請號: 200980154905.1
• 申請日: 2009-12-21
• 公開（公告）號: CN102317305A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 安德魯·格雷厄姆·沃茨;特倫斯·坎特納;阿曼達·芭芭拉·麥肯齊
• 申請（專利權）人: 巴斯大學
• 主分類號: C07K1/13
• 分類號: C07K1/13;A61K47/48
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;韓宏星

技術領域

本發明涉及官能化試劑以及利用它們修飾蛋白質和多肽的方法。本發明還涉及通過本發明方法制備的官能化多肽的用途。更具體而言，本發明應用與偶聯伴侶(coupling?partner)共價連接的官能化試劑，所述官能化試劑包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環。典型地，所述偶聯伴侶(例如聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團)能夠改變多肽的性質。

背景技術

現有技術中已知，可使聚乙二醇(polyethylene?glycol，PEG)聚合物與治療性多肽共價連接，該過程稱為聚乙二醇化(PEG化)。通常典型地使用包含官能團(例如羥基、巰基、胺基或羧酸基團)的衍生物使多肽與PEG分子的反應性衍生物反應來進行PEG化。在PEG化反應中，PEG分子的反應性官能團與多肽中存在的氨基酸的氨基、羧基或硫醇基基團或者與多肽的反應性N-末端或C-末端形成穩定的共價鍵。一般而言，PEG化反應需要使用反應性交聯劑，例如馬來酰亞胺。

然而，還已知PEG化是相對不受控制的反應，主要是因為使用反應性交聯劑，并且因為PEG分子可以多種不同的方式與多肽中存在的多個官能團反應，從而產生不均一的產物。這意味著所得PEG化多肽可具有直鏈或支鏈結構和/或可具有可變數量的與每個多肽偶聯的PEG分子。該反應還受諸如蛋白質類型和濃度、反應時間、溫度和pH值的因素的影響，所有這些因素均對反應最終產物有影響。

一般而言，進行PEG化以影響多肽(尤其是靜脈內施用的那些)的藥代動力學或免疫學特性。特別地，可對多肽進行改變以改善其穩定性、生物半衰期、水溶性和免疫學特性。認為對多肽進行PEG化使其質量增加(例如增加20-50kDa)意味著其更不容易通過腎臟排泄，因此在體內存在更長時間。此外，認為PEG化多肽被保護而不受內源性酶的降解。這也有助于延長其體內半衰期。還認為延長體內半衰期和提高多肽藥物效力可導致降低患者需要的多肽的頻率或劑量，從而有助于降低針對多肽的免疫反應。PEG化還可有助于提高疏水性多肽的水溶性。

然而，雖然PEG化多肽的特性是所期望的(尤其是對于治療性多肽而言)，但是在PEG化反應中缺乏控制仍然是一個問題，因為這常常得到一系列具有多種不同特性的產物。此外，因為多肽是復雜分子，所以難以使用保護基來控制反應的位點和/或程度，例如這在小分子化學中是可能的。

多肽糖基化是翻譯后修飾的天然形式，其改變多肽的結構和功能。從本質上來說，糖基化是由導致不同類型糖基化多肽的位點特異性修飾的酶促過程介導的。在N-連接的糖基化中，聚糖與天冬酰胺側鏈的酰胺氮相連，在O-連接的糖基化中，聚糖與絲氨酸和蘇氨酸側鏈的羥基氧相連。其它形式的糖基化包括與絲氨酸的羥基氧相連的糖胺聚糖、其中聚糖與神經酰胺相連的糖脂、不與蛋白質或脂質相連的透明質酸、以及通過聚糖連接使蛋白質與脂質相連的GPI錨定蛋白。

現有技術中存在的普遍問題是糖基化常添加到真核細胞中的多肽上，而很少添加到在常用治療性多肽重組表達的原核宿主中表達的多肽上。在原核宿主中產生的多肽缺少糖基化可導致所述多肽被識別為異物或者意味著它們具有不同于其天然形式的其它特性。難以通過基因工程在多肽的非天然糖基化位點上進行糖基化以試圖將這用于調節多肽特性也是一個問題。

WO?88/05433公開了用于制備多肽與信號產生或細胞毒性化學實體之綴合物的交聯劑。所述交聯劑由一系列含氮芳香雜環化合物組成，特別是2-、3-或4-乙烯基吡啶和乙烯基嘧啶，所述信號產生或細胞毒性化學實體可通過所述交聯劑中存在的活化酯取代基與所述含氮芳香雜環化合物相連。綴合反應在于使所述試劑的乙烯基與多肽中存在的硫醇基反應。WO?88/05433中公開的化合物均包含吸電子取代基作為所述含氮芳香雜環的官能團。還應當注意的是，WO?88/05433未提供任何表明利用交聯劑使信號產生或細胞毒性化學實體與多肽相連的實施例。

WO?2005/024041描述了用于蛋白質組學方法中的對兩個或更多個細胞群中蛋白質加質量標簽的方法。該加標簽方法包括使一個群中的半胱氨酸殘基與2-乙烯基吡啶反應，而另一個群中的半胱氨酸殘基與C_1-4烷基取代的2-乙烯基吡啶反應，從而產生具有可通過質譜區分之質量的加標簽蛋白質。

Banas等人(Biochimica?et?Biophysica?Acta，957(2)：178-84，1988)研究了大腸桿菌(E.coli)磷酸果糖-1-激酶半胱氨酸殘基的反應性，利用乙烯基吡啶、溴代丙酮酸酯和二硫代硝基苯甲酸來確定多肽中存在的6個半胱氨酸殘基的相對反應性。