[發(fā)明專利]人胚胎干細(xì)胞向胰腺內(nèi)分泌譜系的分化

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980153742.5
• 申請日: 2009-10-22
• 公開（公告）號: CN102333862B
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A·雷扎尼亞
• 申請（專利權(quán)）人: 詹森生物科技公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 李進(jìn),林毅斌

本發(fā)明要求于2008年10月31日提交的序列號為61/110,278的申請的 優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了促進(jìn)多能干細(xì)胞分化的方法。具體地講，本發(fā)明提供了一 種增加與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標(biāo)記物表達(dá)的方法。

背景技術(shù)

用于I型糖尿病的細(xì)胞替代療法的進(jìn)展以及可移植胰島的缺乏已使得注 意力集中在開發(fā)適于移植物移入的胰島素生成細(xì)胞或β細(xì)胞的來源上。一種 方法是從多能干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生功能性β細(xì)胞。

在脊椎動物的胚胎發(fā)育中，多能干細(xì)胞可在稱為原腸胚形成的過程中產(chǎn) 生包括三個胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的細(xì)胞群體。諸如甲狀腺、胸 腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織將從內(nèi)胚層，經(jīng)由中間階段發(fā)育而來。該過 程中的中間階段是形成定形內(nèi)胚層。定形內(nèi)胚層細(xì)胞可表達(dá)多種標(biāo)記物，例 如HNF-3β、GATA4、Mixl1、CXCR4和Sox-17。

定形內(nèi)胚層分化成胰腺內(nèi)胚層導(dǎo)致形成胰腺。胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)胰- 十二指腸同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1時，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后 不再發(fā)育。因而，Pdx1表達(dá)標(biāo)志著胰腺器官發(fā)生中的一個關(guān)鍵步驟。除了其 他細(xì)胞類型，成熟的胰腺還包括外分泌組織和內(nèi)分泌組織。外分泌和內(nèi)分泌 組織來自胰腺內(nèi)胚層的分化。

據(jù)報(bào)道，從小鼠的胚胎細(xì)胞衍生了帶有胰島細(xì)胞特征的細(xì)胞。例如， Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)報(bào)道了小鼠胚胎干細(xì)胞向類似胰島的 胰島素分泌結(jié)構(gòu)的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)報(bào)道，衍生自小鼠 胚胎干細(xì)胞的胰島素分泌細(xì)胞使鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中的血糖變 正常。

例如，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶 (LY294002)的抑制劑處理小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生了類似β細(xì)胞的細(xì)胞。

又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)報(bào)道，從組成型表達(dá)Pax4 的小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生了胰島素生成細(xì)胞。

Micallef等人報(bào)道說，視黃酸可調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞定向形成Pdx1陽性胰 腺內(nèi)胚層。在對應(yīng)于胚胎的原腸胚形成末的期間，加入胚胎干細(xì)胞分化第4 天的培養(yǎng)物中時視黃酸是誘導(dǎo)Pdx1最有效的(Diabetes 54：301，2005)。

Miyazaki等人報(bào)道了過表達(dá)Pdx1的小鼠胚胎干細(xì)胞系。他們的結(jié)果顯 示，外源Pdx1表達(dá)在所得的分化細(xì)胞中明顯增強(qiáng)了胰島素、生長抑素、葡 萄糖激酶、神經(jīng)元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表達(dá)(Diabetes 53：1030， 2004)。

Skoudy等人報(bào)道說，激活素A(TGF-β超家族的成員)能上調(diào)小鼠胚 胎干細(xì)胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和內(nèi)分泌基因(Pdx1、胰島 素和胰高血糖素)的表達(dá)。使用1nM激活素A時觀察到最大的效果。他們 還觀察到，胰島素和Pdx1 mRNA的表達(dá)水平不受視黃酸的影響；然而，3nM FGF7處理導(dǎo)致Pdx1的轉(zhuǎn)錄水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。

Shiraki等人研究了能特征性增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞分化成Pdx1陽性細(xì)胞的生 長因子的效果。他們觀察到，TGF-β2可再現(xiàn)地產(chǎn)生更高比例的Pdx1陽性細(xì) 胞(Genes Cells.2005年6月；10(6)：503-16)。

Gordon等人闡明了在不存在血清的情況下和在存在激活素連同Wnt信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的情況下從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)brachyury⁺/HNF-3β⁺內(nèi)胚層細(xì) 胞(US 2006/0003446A1)。

Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806頁，2006年)聲稱：“Wnt 和TGF-β/nodal/激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)同時為前原條的產(chǎn)生所必需”。

然而，胚胎干細(xì)胞發(fā)育的小鼠模型可能不會完全模擬高等哺乳動物(例 如人)中的發(fā)育程序。

Thomson等人從人胚泡分離了胚胎干細(xì)胞(Science 282：114，1998)。同 時，Gearhart和其同事從胎兒生殖腺組織衍生了人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞系 (Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。與可簡單通 過與白血病抑制因子(LIF)一起培養(yǎng)來防止分化的小鼠胚胎干細(xì)胞不一樣，人 胚胎干細(xì)胞必須維持在非常特殊的條件下(美國專利No.6,200,806、WO 99/20741、WO 01/51616)。