[發明專利]采用拉曼光譜法分離、表征和/或鑒定微生物的方法

有效

• 申請號: 200980153296.8
• 申請日: 2009-10-30
• 公開（公告）號: CN102272585A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 布拉德福德·克萊;瓊斯·海曼;約翰·沃爾什;瑟曼·索普;克里斯多夫·羅恩斯克
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃公司
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;C12M1/12;C12M1/34
• 代理公司: 北京市德恒律師事務所 11306
• 代理人: 陸鑫;高雪琴

相關申請的交叉參考

本申請要求享有于2008年10月31日提交的題為“Method?and?System?for?Detection?and/or?Characterization?of?a?Biological?Particle?in?a?Sample”的美國臨時專利申請第61/110,187號的權益，將其結合于本文中作為參考。

技術領域

本發明涉及用于檢測、分離和/或鑒定樣品中的微生物的方法和系統。具體而言，本發明涉及利用拉曼光譜技術快速表征和/或鑒定微生物的直接方法。

背景技術

檢測生物學流體中的病原微生物，應該在盡可能最短的時間內進行，尤其是在敗血癥的情況下，對于該病癥盡管醫生可利用的抗生素的范圍廣泛，但是其死亡率仍然保持較高。生物學活性劑(諸如微生物)在患者體液尤其是血液中的存在，一般采用血培養瓶進行檢測。血流感染與高的發病率和死亡率有關，然而當前的診斷方法即培養之后進行生物化學鑒定和抗生素敏感性測試，可能要耗費幾天時間來進行。通常，基于臨床癥狀開始經驗療法，而只有當初始療法失效時測試結果才會影響臨床決策。在陽性血液培養結果之后的最初幾個小時內、優選1個小時內表征血液感染的能力，將會顯著地加強所提供的診斷信息的臨床相關性。已經提出了分子擴增方法來填補這方面的需要，但是對于這種方法仍然存在嚴重的挑戰。陽性血液培養液自身代表具有用于各種快速、鑒定(ID)測試的潛能的天然擴增的微生物種群。

為了提供穩健的結果，傳統的自動表型ID測試(諸如Vitek、Phoenix^TM和Microscan系統)或手動表型測試(諸如API)要求微生物處于適當的生長階段并且無干涉培養基和血液產物。這些系統利用在平板培養基上從陽性培養液中生長16～24小時的菌落。然而，為了獲得更快的結果，一些實驗室已經報道了采用這些系統及從陽性血培養瓶中分離的微生物。這些直接獲自培養瓶的試驗并不是對于所有的微生物(例如，革蘭氏陽性球菌)都是適當的，未經測試廠商驗證，并且一般要花費3～8小時才能提供結果。迫切需要更快且更廣泛的特異性試驗，以便在陽性培養結果之后的最初幾個小時內、優選1個小時內為醫師提供臨床上相關的結果。

拉曼光譜法具有實現非常快速地鑒定微生物的潛能，但是可能會遇到在液體微生物培養基中和臨床樣品諸如血液或其組合中存在的許多高度熒光和吸收性化合物的干擾。直接從陽性血液培養液中回收微生物的最常用的方法是兩步差速離心和在血清分離器管中的離心。

已經描述了用于分離、表征和/或鑒定微生物的其它方法，包括：

美國專利第4,847,198號公開了一種利用UV激發拉曼光譜法鑒定微生物的方法。根據′198專利，通過紫外光譜范圍內的單波長接觸細菌懸浮液。部分所用的光能被吸收而部分光能被發射。發射的光能，共振增強拉曼散射，作為反向散射能量進行測定。對該能量進行處理以產生細菌的特征性光譜。

Vo-Dinh的美國專利第5,938,617號涉及一種系統，該系統通過用幾個波長的光激發樣品并同步采集發射強度來鑒定樣品中生物病原體。系統包括用于將樣品暴露于激發輻射并由此產生發射輻射的機制。生物病原體可能是病毒和細菌。

美國專利第6,177,266號公開了一種采用通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)分析細胞蛋白提取物或整個細胞產生的屬、種和菌株的特異性生物標記對細菌進行化學分類學分類的方法。

在美國專利第7,070,739號中，顯示了一種通過二維超離心直接從體液或均質化組織中提取、分離和純化微生物(包括病毒)的方法。在第一步離心步驟中，將沉降速度高于待鑒定的微生物的沉降速率的所有粒子除去。在第二步超離心步驟中，采用專用鋸齒離心管，于填充的流體中應用等密度分帶以形成寬范圍的密度梯度。根據該專利，分離技術能夠用于通過利用核酸特異性染料的光散射或熒光檢測分帶的粒子，以及用于以非常小的體積回收分帶的粒子，從而通過質譜分析病毒蛋白亞單位和完整的病毒粒子以及通過熒光流量細胞計數測定核酸的質量和由限制酶產生的片段的質量進行表征。