[發明專利]在植物原生質體中使用雙鏈RNA提高靶基因改變的效率

無效

• 申請號: 200980151853.2
• 申請日: 2009-12-22
• 公開（公告）號: CN102257147A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: P·本多克
• 申請（專利權）人: 凱津公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/01;C12N15/10;A01H1/06
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

技術領域

本發明涉及生物技術，特別是植物生物技術。本發明尤其涉及在dsRNA分子的存在下使用突變核苷堿基在植物原生質體中進行靶基因改變的方法。本發明進一步涉及提高靶基因改變的效率和使用該技術進行基因改變的應用。

背景技術

遺傳修飾是為了修飾細胞的一個或多個遺傳編碼的生物特性而有意地在該活細胞或部分由細胞形成的生物體或可以再生的生物體的遺傳物質上形成變化的過程。這些變化可以采取部分遺傳物質的刪除，外源遺傳物質的添加，或現有遺傳物質核苷酸序列的變化的形式。真核生物的遺傳修飾方法已被獲知超過20年，被廣泛地應用于植物，人和動物細胞和微生物中，以在農業，人類健康，食品質量和環境保護領域獲得改進。遺傳修飾的常規方法包括：將外源DNA片段添加至細胞基因組中，然后由其賦予該細胞或它的生物體超越現存基因編碼特性之上的新特性(包括由其抑制現存基因的表達的應用)。盡管許多這類示例可有效地獲取期望特性，但是這類方法不是非常精確，因為不能控制插入外源DNA片段的基因組位置的對照(因此不能控制最終的表達水平)，因為期望效果必須在由原始且均衡基因組所編碼的天然特性中顯現。相反地，會導致預定基因組位點中核苷酸的添加，刪除或轉變的遺傳修飾方法可實現現有基因的精確修飾。

定向于靶基因改變的突變核苷堿基(TGA)是基于將合成的突變核苷堿基(其是包含在Watson-Crick堿基配對特性上與DNA類似的短直核苷酸樣基序，但在化學上區別于DNA的分子)遞送至真核細胞核內的方法(Alexeev?and?Yoon，Nature?Biotechnol.16：1343，1998；Rice，Nature?Biotechnol.19：321，2001；Kmiec，J.Clin.Invest.112：632，2003)。通過在突變核苷堿基的同源序列上有意設計錯配核苷酸，可以將該錯配核苷酸拷貝至基因組DNA序列中。該方法實現了現有位點中單個或至多幾個核苷酸的轉變，但可應用于在現有基因上形成終止密碼子由此破壞其功能，或形成密碼子，其導致具有改變的氨基酸組成的基因編碼蛋白(蛋白工程)。

已描述了在植物，動物和酵母細胞中的TGA。在這些研究中使用了兩種不同類型的合成突變核苷堿基，嵌合DNA:RNA類型(嵌合體)或單鏈類型。