[發明專利]制備能夠形成包含體的蛋白的方法

有效

• 申請號: 200980151805.3
• 申請日: 2009-10-21
• 公開（公告）號: CN102257139A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 中武博;米田明廣;末永清剛;平島正樹;前田浩明
• 申請（專利權）人: 一般財團法人化學及血清療法研究所;帝人制藥株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/21;C12P21/02;C12N9/64
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 梁謀;郭文潔

1.一種核酸片段，其由編碼表達于原核細胞時形成包含體的蛋白(包含體形成蛋白)的核苷酸序列組成，所述核酸片段包含編碼修飾的信號肽的核苷酸序列和編碼目的蛋白的核苷酸序列。

2.權利要求1的核酸片段，其中所述原核細胞是革蘭氏陰性細菌。

3.權利要求1或者2的核酸片段，其中所述原核細胞是大腸桿菌(E.coli)。

4.權利要求1到3任一項的核酸片段，其中所述目的蛋白是原基質金屬蛋白酶7(proMMP-7)或者C型副雞禽桿菌(Avibacterium?paragallinarum)的HMTp210。

5.權利要求1到4任一項的核酸片段，其中所述修飾的信號肽是修飾的來自原核生物的穿越內膜的蛋白的信號肽。

6.權利要求5的核酸片段，其中所述蛋白選自堿性磷酸酶、OmpA、PelB、OmpT、LamB、OmpF和β-內酰胺酶。

7.權利要求5的核酸片段，其中所述修飾的信號肽是修飾的PhoA-堿性磷酸酶的信號肽(修飾的APSP)。

8.權利要求7的核酸片段，其中所述修飾的APSP的氨基酸序列示于SEQ?ID?NO：1，其第13位的亮氨酸由選自脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的任一氨基酸置換。

9.權利要求7的核酸片段，其中所述修飾的APSP的氨基酸序列示于SEQ?ID?NO：1，其第21位的丙氨酸由選自天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的任一氨基酸置換。

10.權利要求7的核酸片段，其中所述修飾的APSP的氨基酸序列示于SEQ?ID?NO：1，其第13位的亮氨酸由選自脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的任一氨基酸置換以及第21位的丙氨酸由選自天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的任一氨基酸置換。

11.權利要求1到10任一項的核酸片段，其中編碼目的蛋白的核苷酸序列置于編碼所述修飾的信號肽的核苷酸序列的下游。

12.摻入了權利要求1到11任一項的核酸片段的表達載體。

13.用權利要求12的表達載體轉化宿主獲得的產生包含體形成蛋白的宿主。

14.權利要求13的產生包含體形成蛋白的宿主，其中所述宿主為原核細胞。

15.權利要求13或者14的產生包含體形成蛋白的宿主，其中所述宿主為革蘭氏陰性細菌。

16.權利要求13到15任一項的產生包含體形成蛋白的宿主，其中所述宿主是大腸桿菌。

17.一種制備表達于原核細胞時形成包含體的蛋白(包含體形成蛋白)的方法，其包括以下步驟(1)到(3)：

(1)制備包含權利要求1到11任一項的核酸片段的表達載體，

(2)制備上面步驟(1)的所述表達載體轉化的產生包含體形成蛋白的宿主細胞，和

(3)從培養上面步驟(2)的產生所述包含體形成蛋白的所述宿主細胞獲得的培養物中純化所述的包含體形成蛋白。

18.權利要求17的方法，其中所述表達載體是權利要求1-11任一項的核酸片段摻入到T7啟動子下游的表達載體。

19.權利要求17或者18的方法，其中所述宿主是原核細胞。

20.權利要求17到19任一項的方法，其中所述宿主是革蘭氏陰性細菌。

21.權利要求17到20任一項的方法，其中所述宿主為大腸桿菌。

22.權利要求17到21任一項的方法，其中產生所述包含體形成蛋白的所述宿主細胞培養于無抗生素的培養基中。