[發(fā)明專利]使用二氧化碳控制肺炎鏈球菌多糖分子量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980150897.3
• 申請日: 2009-12-17
• 公開（公告）號: CN102257127A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J·H·克林尼恩
• 申請（專利權(quán)）人: 惠氏有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/04;A61K39/09;C08B37/00
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及增加分離的在糖重復(fù)單元之間具有磷酸二酯鍵的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分子量的方法。

背景

在制備預(yù)防由肺炎鏈球菌(Streptococcus?pneumoniae)(也稱作肺炎球菌)生物體導(dǎo)致的侵襲性疾病的多價(jià)綴合的肺炎疫苗中，使選擇的肺炎鏈球菌血清型生長以提供產(chǎn)生疫苗所需的多糖。細(xì)胞在發(fā)酵罐中生長，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)通過加入脫氧膽酸鈉或者另外的裂解劑誘導(dǎo)裂解。然后收獲裂解物肉湯以進(jìn)行下游的純化及回收圍繞細(xì)菌細(xì)胞的莢膜多糖。在與載體蛋白綴合后，所述多糖包含于最終的疫苗產(chǎn)物中，并賦予疫苗靶向群體對于選定的肺炎鏈球菌血清型的免疫力。

多糖大小是在每個(gè)批次制品中測定的質(zhì)量屬性，且必須適當(dāng)控制。傳統(tǒng)的處理方法在發(fā)酵期間使用NaOH(氫氧化鈉)作為堿滴定劑。使用NaOH的優(yōu)勢在于能降低脫氧膽酸裂解物的pH而不形成泡沫，以便除去蛋白質(zhì)和改良過濾。將這個(gè)材料進(jìn)行離心，隨后過濾以除去低至0.45μm額定尺寸(nominal?size)的大多數(shù)固體。然而，對于糖重復(fù)單位之間具有磷酸二酯鍵的血清型(例如6A、6B、19A和19F)而言，這種傳統(tǒng)處理方法產(chǎn)生的多糖分子量較低(＜450kDa)。

因此，需要從細(xì)胞肺炎鏈球菌裂解物中、特別是從含有肺炎鏈球菌血清型6A、6B、19A或者19F多糖的裂解物中回收高分子量莢膜多糖的改良的方法。

發(fā)明簡述

本發(fā)明提供了從肺炎鏈球菌細(xì)胞裂解物中回收高分子量的莢膜多糖的改良的方法，所述裂解物含有在糖重復(fù)單元之間具有磷酸二酯鍵的血清型。在一種方法中，向糖重復(fù)單元之間含有磷酸二酯鍵的肺炎鏈球菌血清型的發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括如下步驟：1)制備肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物，其產(chǎn)生重復(fù)單元之間包含磷酸二酯鍵的莢膜多糖；2)向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂；3)裂解發(fā)酵培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞；以及4)從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌莢膜多糖，其中產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖的溶液，多糖在重復(fù)單元之間含有磷酸二酯鍵。

在一具體的實(shí)施方案中，制備產(chǎn)生多糖血清型19A、6A、19F、6B及其組合的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物。在另一具體的實(shí)施方案中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂包括在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸氫根離子(HCO₃^-)，例如在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入NaHCO₃(碳酸氫鈉)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂包括在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸根離子(CO₃^2-)，例如在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入Na₂CO₃(碳酸鈉)。在另一實(shí)施方案中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂包括首先加入NaHCO₃其次加入Na₂CO₃。在另一個(gè)實(shí)施方案中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂包括用CO₂覆蓋發(fā)酵培養(yǎng)物。在另一實(shí)施方案中，分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分子量為至少700kDa。在另一實(shí)施方案中，提供了含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖的溶液，其中所述多糖在重復(fù)單元之間包含磷酸二酯鍵，其中所述溶液通過上文所述方法產(chǎn)生。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液的方法。所述方法包括如下步驟：1)制備肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物，其產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖；2)向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂；3)裂解所述發(fā)酵培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞；及4)從所述發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖；從而產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液。在另一實(shí)施方案中，提供了含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液，其中所述溶液通過上述方法產(chǎn)生。