[發明專利]通過重組酵母口服/粘膜接種疫苗的方法

有效

• 申請號: 200980150388.0
• 申請日: 2009-11-13
• 公開（公告）號: CN102741414A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: K·布羅伊尼希;S-E·貝倫斯
• 申請（專利權）人: 哈雷-維滕貝格馬丁-路德大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 林曉紅

對傳染病的防范在人類醫學以及獸醫學中依然是巨大的挑戰。對于病毒感染而言情況尤其復雜，與細菌感染相反，其通常不能用廣譜的有效物質來控制且會引起巨大的經濟損失。針對病毒性疾病的新的有效接種疫苗策略的開發因而具有突出的重要意義。

傳統上針對病毒性疾病的預防性以及治療性接種疫苗是經“減毒的”，即利用通過誘變改造的具有顯著降低或者缺失的毒力的病毒(“活疫苗”)、或滅活的病毒(“死疫苗”)。近來，也建立了日益增加的所謂“亞單位疫苗”或者“標記疫苗”，其中使用給定的經遺傳工程改造的病原體“主要抗原(Hauptantigen)”。術語“標記疫苗”意指通過隨后的診斷分析可清楚地將經接種疫苗的個體與自然感染的個體區別開。對于主要抗原可理解為例如病毒包膜或病毒衣殼的蛋白，其在缺乏完整的病毒顆粒時可在宿主中誘導體液和/或細胞免疫應答，作為其結果病毒感染可被阻斷或者被控制。“亞單位接種疫苗”需要先將主要抗原進行表征。這些蛋白的生產(表達)及免疫原性配制對于接種疫苗的過程發揮著關鍵的作用，特別是病毒的外殼蛋白大多數不溶于水并且在細菌表達系統中僅有很少的能被重組表達。以純化的形式獲得“亞單位”疫苗并確保其持久性的方法相應地成本較高。

酵母作為用于重組蛋白的表達系統將細菌系統經濟的優點與高等細胞典型的組織形式結合起來。它們通過細胞內膜系統來區室化(kompartimentiert)，這從根本上將其與細菌宿主系統區別開并且使得膜錨定的病毒外殼蛋白或者甚至是整個病毒衣殼能夠表達。此外，構成酵母細胞壁的β-葡聚糖、葡萄糖聚合物具有長久以來已知的免疫刺激效應。由此，任務是開發一種方法，其中完整的酵母可被用于接種疫苗。此問題由如下方式解決，通過基因工程的方法將免疫原決定簇(immunogene?Determinanten)的基因引入非病原酵母的基因組并表達，并將此重組酵母細胞直接用于接種疫苗以及特別是通過服食而口服接種疫苗。

乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyces?lactis)

乳酸克魯維氏酵母屬于具有GRAS(通常認為安全)級別的所謂的食品級酵母。與作為食品添加劑經過了上千年測試和驗證的面包酵母一樣，在奶制品中通常的代表性酵母乳酸克魯維氏酵母對于食品工業也是安全無害的。

口服/粘膜接種疫苗

對于疫苗/抗原的施用有如下的方式可選擇：皮下、肌內、腸胃外、或粘膜/口服。而在前三種方式中抗原直接進入血液或淋巴管道，對于粘膜/口服應用抗原的暴露則是通過支氣管或胃腸道粘液膜(粘膜)進行的。因而術語粘膜/口服包括抗體的鼻/支氣管施用以及口服施用。支氣管和腸粘膜均持久地暴露于病原體并且其本身是感染的主要接受屏障。與粘膜表面特別是粘膜腸上皮結合的免疫系統包含了例如人體內所有免疫活性細胞的約90％。在腸粘膜中所謂的誘導位點，抗原的接受和呈遞通過樹突細胞和“淋巴集結”的M-細胞(總體上稱為MALT，粘膜相關性淋巴樣組織)而進行，但根據近來的發現也通過腸細胞和腸上皮細胞進行。在鼻/支氣管粘膜上存在類似的組合(BALT，支氣管相關性淋巴樣組織)。在免疫應答緩和(Abklingen)后，在整個生物體以及在粘膜特異性記憶免疫細胞的所謂效應位點通常產生針對原始抗原/病原體介導的長效防護。

口服/粘膜接種疫苗方法的優勢。與腸胃外免疫相比，口服/粘膜免疫需要使用顯著較高的量的抗原。與腸胃外接種介苗相反，通過口服/粘膜接種疫苗可以在誘導全身免疫應答之外還在粘膜的效應位點誘導局部免疫應答。特別是對于(也)通過粘液膜傳播的病原體(如牛病毒性腹瀉病毒BVDV和豬瘟病毒CSFV，見下文)而言，粘膜/口服接種疫苗具有產生有活性且長效免疫的潛力。口服/粘膜接種疫苗的重要優勢還有良好的接受性和經濟性。在最理想的情況下所述疫苗可以低成本生產并方便地與食物一起施用。

用表達病毒抗原的酵母菌株進行的粘膜/口服接種疫苗不僅僅安全無害，還能夠具有額外的健康增強和輔佐效應。

現在的目標是開發出基于乳酸克魯維氏酵母的表達系統，其允許外源基因定向整合到酵母基因組中并因此使得能夠形成適當的抗原。進一步的目標是表達特定病毒抗原的重組乳酸克魯維氏酵母菌株，其用于接種疫苗以及特別是用于粘膜/口服接種疫苗。