[發明專利]生產pH穩定的包膜病毒的方法

有效

• 申請號: 200980147102.3
• 申請日: 2009-11-25
• 公開（公告）號: CN102223895A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 朱莉亞.羅馬諾瓦;安德雷杰.埃戈羅夫;布里吉特.克倫;馬庫斯.沃爾謝克;薩拜因.納科維奇
• 申請（專利權）人: 阿維爾綠山生物技術研究發展貿易股份公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 閔丹

發明領域

本發明提供了一種用于生產pH穩定的包膜病毒的方法，其中所述病毒在低pH條件下與細胞培養細胞一起溫育。此類病毒包括顯示細胞培養中的高生長速率、升高的pH和溫度穩定性且具有人類受體特異性的新型流感病毒。

發明背景

為了預防由一年一度的病毒感染流行引起的疾病，疫苗接種是最重要的公眾健康措施。疫苗的有效供應依賴于快速生產大量疫苗原料(例如病毒)的能力。疫苗的快速開發及它們的豐富可得性在抗擊許多人類和動物疾病中是至關重要的。疫苗生產的延遲和數量不足在解決疾病的爆發時會引起問題。

病毒(尤其是流感病毒)在含胚雞蛋中的生長顯示出導致流感病毒顆粒的有效生產，這可用于生產滅活的或活的減毒流感病毒疫苗株。雖然如此，最近幾年，進行了深入的工作來建立使用細胞培養的病毒生產系統，因為基于蛋的方法需要特定的、無病原體的蛋的穩定供應，這在大流行的情況中會成問題。基于細胞的技術是一種不依賴蛋供應商且一獲得種子病毒就能開始的替代生產工藝。除此之外，自在哺乳動物細胞中培養的病毒制備的滅活型流感疫苗顯示出誘導比蛋培養的疫苗更多的交叉反應性血清抗體且揭示出更好的保護(Alymova?et?al.，1998，J?Virol?72，4472-7)。此外，依照先前的結果，在含胚雞蛋中生長之后，人類隔離群的受體特異性和抗原性特性發生改變(Mochalova?et?al.，2003，Virology?313，473-80；Romanova?et?al.，2003，Virology307，90-7)。

另一方面，病毒在組織培養中的多次擴增常常導致融合的pH升高的HA突變體(Lin?et?al.，1997，Virology?233，402-10)，這與病毒對熱變性的穩定性降低有關(Ruigrok?et?al.，1986)。任何蛋白質的結構及它的穩定性基于非共價相互作用，像疏水力、范德華相互作用、氫鍵、和離子相互作用。已知在病毒適應細胞培養時出現的突變提高因HA分子中改變的離子相互作用和鹽橋而降低的蛋白質穩定性誘導的融合的pH閾(Rachakonda?et?al.，2007，Faseb?J?21，995-1002)。通常見于界面HA1-HA2或HA2-HA2區或HA2的N端中的失穩性突變繼而可導致降低的對細胞表面受體的結合(Korte?et?al.，2007，Rachakonda?et?al.，2007，Faseb?J?21，995-1002，Shental-Bechor?et?al.，2002，Biochim?Biophys?Acta?1565.81-9)，這導致活病毒制備物降低的病毒感染性和隨后降低的免疫原性。

Massaab?H.F.，Journal?of?Immunology.1969，102，pp.728-732使用不同遺傳標志測試了在適應原代雞腎組織培養和含胚蛋中的生長之前和之后冷適應流感病毒的生物學和免疫學特征。指出了與初始的“野生型”株相比這些株對低pH更加敏感，并顯示了感染性和血細胞凝集產量的顯著降低。

Fiszman?et?al，Journal?of?Virology，1974，13，pp.801-808檢驗了低pH(pH6.6)對水泡性口炎病毒(VSV)的影響，并顯示了沒有檢測到病毒顆粒或核殼。Ackermann?W?and?Massaab?H.F.，Journal?of?Experimental?Medicine?FEB?1954，99，pp?105-117披露了病毒抑制劑α-氨基-p-甲氧基-苯基甲磺酸對流感病毒生長周期的影響。

由于難以自細胞培養大量獲得具有高穩定性和免疫原性以避免任何安全性或供應問題的疫苗病毒制備物，本發明的一個目的是獲取產生有效且穩定的病毒的工藝。通過提供本申請的實施方案，實現了該目的。

發明概述

本發明涉及在組織培養中生產pH穩定的包膜病毒的方法，其在稀釋病毒懸液和感染宿主細胞期間采用了降低pH的條件。本發明的方法還提供了一種病毒，其與經當前使用的方法得到的病毒顆粒相比，穩定性和免疫原性升高。

附圖簡述

圖1：Wisc.ΔNS1和Wisc.ΔNS1_HA2_G75R在雪貂中以6.0log?TCID50/動物進行單次鼻內免疫接種后，比較免疫原性。

圖2：

A)在小鼠模型中誘導血清抗體；

B)攻擊病毒在免疫過的小鼠的肺和鼻甲中繁殖。

圖3：

A.初始病毒和突變病毒的HA分子的序列比較。通過定點誘變，將兩個核苷酸(aa)替換成(tt)，導致HA2亞基第58位的氨基酸K變成I。