[發明專利]基于同源重組DNA的克隆方法及組合物

有效

• 申請號: 200980143524.3
• 申請日: 2009-09-10
• 公開（公告）號: CN102124112A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 柳偉強;楊平;王濤;楊平;王珠銀;陳文柱;章方良
• 申請（專利權）人: 金斯瑞公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/20
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 夏平

1.一種將供體DNA分子克隆至受體載體預定位置的方法，該方法包含以下步驟：

a)通過將第一序列和第二序列分別添加至供體DNA分子的5′端和3′端來制備擴展供體DNA分子，其中，第一序列和第二序列中的任一者獨立地至少具12個核苷酸長，且與受體載體的第一區域和第二區域分別至少有90％相一致；

b)提供包含以下物質的反應混合物

i)受體載體，

ii)擴展供體DNA分子，及

iii)包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑；

c)反應混合物經培養獲得中間產物；

d)利用中間產物進行細胞轉化，獲得轉化細胞；及

e)在一定條件下培養該轉化細胞，得到包含位于第一區域與第二區域之間的供體DNA的重組DNA分子。

2.根據權利要求項1所述的方法，其中該受體載體為環形載體或線性載體。

3.根據權利要求項1所述的方法，其中該第一區域與該第二區域分別位于線性載體的3′端和5′端。

4.根據權利要求項1所述的方法，其中第一序列與第二序列分別于第一區域與第二區域完全一致。

5.根據權利要求項1所述的方法，其中利用包含第一序列的第一聚合酶鏈反應(PCR)引物和包含第二序列補體的第二PCR引物，通過聚合物酶鏈反應制備擴展供體DNA分子。

6.根據權利要求項1所述的方法，其中外切酶選自由以下各物組成的群組：大腸桿菌核酸外切酶I、大腸桿菌核酸外切酶III、大腸桿菌核酸外切酶VII、噬菌體λ核酸外切酶、噬菌體T7-核酸外切酶基因及其組合物。

7.根據權利要求項1所述的方法，其中單鏈DNA結合蛋白選自由以下各物組成的群組：極端耐熱單鏈DNA結合蛋白(ET?SSB)、RecA、T4基因32單鏈結合蛋白、嗜熱棲熱菌RecA(Tth?RecA)及大腸桿菌單鏈DNA結合蛋白(SSB)及其組合物。

8.根據權利要求項7所述的方法，其中酶合劑包含由以下酶組合物組成的群組：大腸桿菌核酸外切酶I與RecA、大腸桿菌核酸外切酶III與RecA、大腸桿菌核酸外切酶VII與RecA、噬菌體λ核酸外切酶與RecA、噬菌體T7-核酸外切酶基因6III與RecA、大腸桿菌核酸外切酶I與Tth?RecA、大腸桿菌核酸外切酶III與Tth?RecA、大腸桿菌核酸外切酶VII與Tth?RecA、噬菌體λ核酸外切酶與Tth?RecA、噬菌體T7-核酸外切酶基因6III與Tth?RecA、大腸桿菌核酸外切酶I與ET?SSB、大腸桿菌核酸外切酶I與T4基因32單鏈結合蛋白、大腸桿菌核酸外切酶I與大腸桿菌SSB、大腸桿菌核酸外切酶III與ET?SSB、大腸桿菌核酸外切酶III與T4基因32單鏈結合蛋白、大腸桿菌核酸外切酶III與大腸桿菌SSB、大腸桿菌核酸外切酶VII與ET?SSB、大腸桿菌核酸外切酶VII與T4基因32單鏈結合蛋白；以及大腸桿菌核酸外切酶VII與大腸桿菌SSB。

9.根據權利要求項1所述的方法，其中反應混合物包含約1至約100mg/l的外切酶以及約1至約100mg/l的單鏈DNA結合蛋白。

10.根據權利要求項1所述的方法，其中反應混合物進一步包含約1至約10mg/l三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、約1至約10mg/l的NaCl、約0.1至約10mg/l對乙二胺四乙酸(EDTA)、約0.1至約10mg/l氯化鎂、約10至約200g/l的甘油、約10至50mg/l的牛血清白蛋白(BSA)、約0.1至約10mg/l腺苷-5′-三磷酸(ATP)、0.1至約10g/l二硫蘇糖醇(DTT)，且其中反應混合物的pH為約5.0至約9.0。

11.根據權利要求項1所述的方法，其中步驟(c)中，在約10℃至約38℃的溫度下培養約15分鐘至約60分鐘。

12.根據權利要求項1所述的方法，其中細胞為大腸桿菌細胞，且受體載體為包含復制起點的質粒，其在大腸桿菌細胞中指揮質粒的復制。

13.根據權利要求項1所述的方法，其中轉化細胞表達了來自重組DNA的標記基因，該標記基因使得轉化細胞的選擇或篩選得以完成。