[發明專利]通過代謝競爭除去污染性的非人唾液酸

無效

• 申請號: 200980141681.0
• 申請日: 2009-09-09
• 公開（公告）號: CN102197131A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: A·瓦基;S·迪爾茲;R·泰勒
• 申請（專利權）人: 加利福尼亞大學董事會
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/073;C12N5/02;A61K35/12;A61P31/00;A61P35/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

關于聯邦資助的研究的說明

根據國立衛生研究所授予的獎助金No.GM032373，美國政府在本發明中具有一定的權利。

與相關申請的交叉引用

根據35U.S.C.第119條，本申請要求臨時申請序列No.61/095,414的優先權，所述臨時申請遞交于2008年9月9日，在此將其公開通過引用而并入。

技術領域

本申請在唾液酸化學、代謝和抗原性的領域中。更特別地，本申請涉及N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc)(其為在人中是免疫原性的非人唾液酸)，用于實驗室和人使用的無Neu5Gc哺乳動物產品的生產，和從人體中除去Neu5Gc。

背景

所有的細胞均被糖鏈的密集和復雜的陣列所覆蓋。唾液酸(Sias)是典型地出現在這些鏈的最外部單元處的九碳糖家族。由于它們的末端位置，唾液酸對于許多外源的和內源的受體(例如流感病毒和內源蛋白的涎免凝集素(Siglec)家族)起到結合位點的作用。因此此類糖是預防和治療感染的有用的藥物靶點。它們還涉及各種生物的和病理的過程，例如神經元可塑性和的癌癥轉移。在許多這些情況中，唾液酸的精確結構和其所附著的殘基發揮關鍵性的作用。

胞苷一磷酸-N-乙酰神經氨酸水解酶(CMAH)將唾液酸N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)轉化為N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc)。在非人哺乳動物中，Neu5Gc被許多內源性結合蛋白及病原性生物體(例如細菌和病毒)所識別。人類不能產生內源性的Neu5Gc，因為其CMAH基因中的進化失活突變。

此外，已知Neu5Gc在人中是免疫原性的。該免疫原性被認為對在接觸了哺乳動物產品(例如源自非人哺乳動物或被暴露于非人哺乳動物的化妝品、食物、哺乳動物細胞和細胞產品、以及治療劑)的人中所觀察到的免疫應答起作用。已試圖嘗試使用RNAi抑制CMAH基因的表達而通過改變細胞系來減少所述細胞系中重組產生的人糖蛋白的Neu5Gc含量。(Chenu?S.，等人，Biochim.Biophys.Acta.，1622(2)：133-144，2003)。

概述

非人唾液酸N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc)通過以代謝的方式被分別摻入培養的細胞和人組織中而污染生物治療產品和人體。在第一種情況中，污染來自培養基中源于動物的組分和/或所使用的動物細胞系；而在第二種情況中，污染來自從食物(例如紅肉)中的膳食攝取。本公開的方法除去或減少人受試者、生物治療劑或細胞系中Neu5Gc的量。所述方法包括以人唾液酸N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)，其衍生物、類似物或前體(例如，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc))漫灌系統。所使用的Neu5Ac也可以單體的形式結合至其他分子，或以多聚體的形式(聚唾液酸)結合。在這些情況下，所結合的Neu5Ac將通過細胞過程被釋放然后以類似于被結合的形式的方式起作用。Neu5Ac和Neu5Gc都為被CMP-Sia合成酶活化而競爭。因此，通過在Neu5Gc首次進入細胞時和/或從預先存在的細胞分子的分解再循環時代謝競爭過Neu5Gc，任何來源的過量的Neu5Ac提供了簡單有效的減少或除去Neu5Gc負荷的方法。此外，本公開提供用于減少CMAH陽性動物細胞中的Neu5Gc產生的方法，包括用大丸的或濃度遞增的Neu5Ac漫灌系統，其抑制內源性Neu5Gc的產生。

本公開提供的方法包括以足夠的量、在足夠的時期內、用有效量或遞增量的N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)、其衍生物、類似物或前體培養細胞系以除去或大量地減少細胞或細胞系中的、或由所述細胞或細胞系產生的產品中的Neu5Gc。在一個實施方式中，所述細胞系包含用于治療性蛋白生產的哺乳動物細胞系。在另一個實施方式中，所述細胞系包含hESC、誘導的干細胞、胚狀體細胞或任何其他意在用于人中的治療應用或用于生產治療性產品的細胞。

本公開提供減少生物治療產品中Neu5Gc的量的方法，包括：在包含Neu5Ac的培養基中，在用于生產生物治療產品的條件下培養哺乳動物細胞培養物。

本公開還提供制備用于移植的、含有Neu5Gc的組織的方法，包括將所述組織暴露于缺少Neu5Gc且包含足量的N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)或其前體N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)的培養基。